人呼吸道合胞病毒感染性克隆构建及其验证

人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)是引起全球婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病原体.本研究旨在建立HRSV原型株Long毒株的反向遗传操作系统.通过利用细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)为载体骨架构建HRSV的Long毒株全长质粒(Long-BAC),以pcDNA3.1为载体构建分别表达 HRSVN、P、M2-1 和 L 蛋白(pcDNA3.1-N,pcDNA3.1-P,pcDNA3.1-M2-1 和 pcDNA3.1-L)的四个辅助质粒,将五个质粒共转染于表达T7RNA聚合酶的BSRT7/9细胞系进行病毒拯救.采用间接免疫荧光(Immune fluorescence assay,IFA)和测序方法对拯救的病毒进行鉴定,并评价其在细胞和动物水平的生物学特征.本研究首次成功构建以BAC载体为骨架的HRSV原型株Long感染性克隆,拯救的病毒在不同代数测序结果显示无突变,能够稳定传代,病毒滴度为3×106 PFU/mL;与实验室保存野生型Long株(Long-WT)相比具有相似的细胞生长动力学特性,在12～36h病毒呈指数增长,在36h复制达到最高峰;在感染小鼠后能引起明显的肺部病理变化以及炎性相关细胞因子升高.本研究建立了高效、稳定的HRSV反向遗传学系统,为我国HRSV致病机制研究、疫苗和抗体药物研发提供技术平台.