基于多肽-泊洛沙胺纳米颗粒载体的呼吸道黏膜mRNA疫苗研究

目的 设计并制备mRNA-多肽-泊洛沙胺纳米颗粒(mRNA peptide polymer ternary complex,mRNA-PPTC),考察其理化特性、体外和体内呼吸道组织相关细胞递送效率、免疫后小鼠特异性抗体诱导能力.方法 通过体外转录分别制备编码萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,F-luc)、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和新冠病毒受体结合域蛋白(receptor binding domain,RBD)的mRNA,利用动态光散射法检测mRNA-PPTC的粒径、多分散系数、Zeta电位.通过透射电镜观察纳米颗粒形态.将F-luc mRNA-PPTC及对照组制剂分别转染至人支气管上皮细胞(16 human bronchial epithelial cell,16HBE)、鼠源树突状细胞(dendritic cell 2.4,DC2.4)、鼠源巨噬细胞(mouse leukemia cells of monocyte macrophage,RAW264.7),检测荧光素酶报告基因转染效率和细胞活性;将EGFP mRNA-PPTC及对照组制剂转染至16HBE细胞,使用荧光显微镜观察EGFP表达情况.利用活体成像技术考察F-luc mRNA-PPTC在小鼠呼吸道的转染效率.选用编码RBD蛋白的mRNA作为疫苗抗原模型,通过酶联免疫吸附实验检测免疫后小鼠血清中抗原特异性免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中抗原特异性分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)水平.结果 成功制备粒径约100 nm近球形且均一稳定的弱阳离子mRNA-PPTC纳米颗粒;mRNA-PPTC能有效转染16HBE、DC2.4、RAW264.7细胞,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),并且细胞毒性较低;mRNA-PPTC通过滴鼻免疫后,在小鼠鼻部和肺组织中检测到F-luc报告基因的有效表达,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);在初免后第28天的小鼠血清和BALF样品中,能分别检测到高效价的RBD抗原特异性IgG和sIgA,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05).结论mRNA-PPTC纳米颗粒有良好的体外mRNA递送能力且细胞毒性较低;滴鼻给药后在小鼠上下呼吸道均能高效表达目的基因;小鼠滴鼻免疫后能产生高水平的抗原特异性血清IgG和支气管肺泡灌洗液sIgA.