梨叶片原生质体制备方法的建立及其基因瞬时转化试验

以'新梨7号'梨叶片为材料,探究影响原生质体分离的主要因素,制备高产优质的叶肉原生质体,并进行基因瞬时转化和表达.将继代30 d的组培苗嫩叶在最佳酶解液(1.0％纤维素酶,0.1％果胶酶,0.4％离析酶,0.5 mol·L-1甘露醇,20 mmol·L-1 KC1,20 mmol·L-1 MES,10 mmol·L-1 CaCl2,1.0 g·L-1 BSA)中酶解12 h,可制备出产量为1.09×106protopl·mL-1、活力为90％的原生质体.将1～2 μg·mL-1 pROK2-GFP质粒DNA通过40％PEG-4000介导转化至上述原生质体中并培养12 h,可以观察到GFP绿色荧光信号,转化率可达40％.