红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)卵黄蛋白原未知功能结构域(DUF1943)的原核表达及纯化鉴定

通过外源表达并纯化得到红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)的DUF1943结构域片段,为开展其后续相关功能及机制研究奠定基础.根据GenBank数据库中公布的红螯螯虾卵Vg基因序列(登录号AF306784.1),查找到DUF 1943结构域的氨基酸序列(617-918aa),对其理化性质与基本结构等进行了理论评估,结合大肠杆菌密码子偏好对其进行了序列改造和密码子优化,采用全基因合成的方法得到了DUF1943的基因片段,将其连接到Pet28a(+)内构建了Pet28a(+)-DUF194的融合表达载体,探索了该融合载体在大肠杆菌系统中的最佳表达参数,采用溶解法和上柱层析法对收获到的蛋白包涵体进行复性.全基因合成方法制备得到的DUF1943目的 基因为921 bp,成功构建了Pet28a(+)-DUF1943的融合表达载体,诱导Pet28a(+)-DUF194表达的最佳条件为:当单克隆菌液OD600达到0.6时,添加0.5 mmol·L-1的诱导剂IPTG,置于37℃条件下培养4h.表达的DUF 1943多肽以包涵体形式为主,在SDS-PAGE胶的35 kDa附近呈现特异性条带,收集包涵体进行破碎,经2 mol·L-1盐酸胍溶解和Ni-NTA层析后最终收获到的活性蛋白浓度为0.6 mg·mL-1.成功构建了Pet28a(+)-DUF1943原核表达载体并优化了表达系统及蛋白复性方案,获得了DUF1943活性多肽,为进一步研究其生物功能及应用奠定了基础.