猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增检测方法的建立及应用

[目的]建立猪瘟病毒(CSFV)快速、灵敏的检测方法.[方法]选择CSFV基因组中保守的5′端非编码区(NTR)作为研究对象,根据重组酶聚合酶扩增(RPA)原理,设计特异性RPA引物和exo探针,并对反应温度和时间进行优化,建立检测猪瘟病毒的实时荧光RPA方法.[结果]该研究建立的方法能在39℃恒温条件下30 min内得到检测结果,实现了快速检测CSFV的目的.该方法仅对CSFV的核酸有扩增反应,而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪肺炎支原体(Mhp)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪水疱病病毒(SVDV)和猪细小病毒(PPV)8种常见猪病病原的检测结果均为阴性,表现出良好的特异性,对含有CSFV目的片段的重组质粒的最低检测限为8.3×102 copies/μL.同时使用新建立的CSFV实时荧光RPA检测方法和国家标准(GB/T 16551—2020)中的实时荧光RT-PCR对采集自重庆某养猪场的33份临床样本进行CSFV核酸检测,以验证CSFV的实用性,结果显示,2种方法检出的阴、阳性样本完全一致.[结论]该研究建立的CSFV实时荧光RPA方法反应条件温和、核酸扩增迅速、检测结果特异、灵敏,为CSF的诊断提供了新的选择.