荣筋拈痛方对膝关节软骨细胞外基质代谢的作用及机制

背景:课题组前期动物实验研究表明,荣筋拈痛方可通过LncRNA GAS5/miR-21影响软骨基质分解和合成代谢,以达到防治膝骨关节炎的作用.LncRNA GAS5/miR-21能否作为防治膝骨关节炎的靶点,仍需从细胞水平研究验证.目的:从细胞水平探讨荣筋拈痛方防治膝骨关节炎的作用机制.方法:①8周龄SPF级雄性SD大鼠40只,随机分组后给予生理盐水、荣筋拈痛方(0.45 g/mL)、盐酸氨基葡萄糖胶囊(0.015 g/mL)灌胃,制备含药血清.②分离培养SD大鼠膝关节软骨细胞,采用白细胞介素1β干预软骨细胞,诱导退变软骨细胞模型,采用CCK-8法明确含药血清干预软骨细胞的量效时效关系.③将第2代软骨细胞分为空白组(空白血清)、模型组(白细胞介素1β+空白血清)、治疗组(白细胞介素1β+荣筋拈痛方含药血清)、对照组(白细胞介素1β+盐酸氨基葡萄糖胶囊含药血清)诱导干预48 h,Real-time PCR法和Western blot法检测各组软骨细胞血清干预后LncRNA GAS5、miR-21、基质金属蛋白酶抑制物3(tissue inhibitor of metalloproteinases 3,TIMP-3)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)3、MMP-9、MMP-13和解聚蛋白样金属蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS-5)基因及蛋白表达.④慢病毒转染软骨细胞过表达LncRNA GAS5,分为LncRNA GAS5空载体+空白血清组、LncRNA GAS5空载体+荣筋拈痛方含药血清组、LncRNA GAS5过表达+空白血清组、LncRNA GAS5过表达+荣筋拈痛方含药血清组,各组干预后Real-time PCR检测LncRNA GAS5、miR-21、TIMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5基因表达.结果 与结论:①荣筋拈痛方含药血清体积分数为10％、培养48 h;盐酸氨基葡萄糖胶囊含药血清体积分数为15％、培养48 h,能显著提高软骨细胞活性;②干预48 h后,与模型组相比,荣筋拈痛方含药血清和盐酸氨基葡萄糖胶囊含药血清均能抑制LncRNA GAS5、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5基因和蛋白的表达(P<0.05),促进miR-21、TIMP-3基因和蛋白表达(P<0.05);③与空载体组相比,LncRNA GAS5过表达组LncRNA GAS5、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5基因表达量明显升高(P<0.05),miR-21、TIMP-3基因表达量明显降低(P<0.05);与LncRNA GAS5过表达+空白血清组相比,LncRNA GAS5过表达+荣筋拈痛方含药血清组MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5 mRNA表达量均降低(P<0.05),miR-21、TIMP-3基因表达量升高(P<0.05);④结果表明,荣筋拈痛方通过调控LncRNA GAS5/miR-21,促进TIMP-3的表达,抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5等表达,从而延缓退变软骨细胞外基质降解,起到防治膝骨关节炎的作用.