三重PCR和双重荧光探针法检测ALV-A/J亚群方法的建立与应用

为快速检测禽白血病病毒(avian leukemia virus,ALV)并同时鉴别A亚群(ALV-A)和J亚群(ALV-J),根据ALV不同亚群基因设计特异性引物和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立通用型、A亚群与J亚群三重PCR以及A亚群与J亚群双重荧光探针检测方法.结果显示:三重PCR检测方法能特异性扩增ALV所有亚群以及A亚群和J亚群,检测灵敏度达 1×103 拷贝/μL;建立的ALV-A/J双重荧光探针检测方法特异性强,可检测的最低拷贝浓度为 40 拷贝/μL.本研究建立的三重PCR方法与商品化ALV实时荧光PCR检测试剂盒均有较高的符合率(Kappa系数＞0.75);针对 24 份发病鸡精液,ALV-A/J双重荧光探针检测方法与商品化ALV实时荧光PCR检测试剂盒检测结果一致;本研究建立的两种检测方法均能同时鉴别出ALV A亚群和J亚群.利用本研究建立方法对安徽省 394 份临床样本进行检测,发现ALV总阳性率为 38.58％,以J亚群单一感染为主,同时伴有A亚群单一感染以及A/J亚群混合感染.结果表明,本研究建立的ALV-通用型/A亚群/J亚群三重PCR方法和ALV-A/J亚群双重荧光探针检测方法特异性强,检测快速,具有临床样本检测的应用潜力,为临床上快速诊断及有效防控ALV感染及鉴别A/J亚群的单一或混合感染提供了技术支持.