单增李斯特菌Lm4b02324基因缺失株的构建及生物特性研究

[目的]研究Lm4b_02324基因编码的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶对单增李斯特菌生物学特性的影响,为研究单增李斯特菌的致病机制奠定基础.[方法]本研究使用重叠延伸PCR技术,并通过连续传代来构建稳定遗传野生型单增李斯特菌Lm928株的Lm4b 02324基因缺失株(Lm928△m4b_02324)与Lm4b 02324基因回补株(CLm928△m4b 02324).通过检测不同培养时间的D600nm值并绘制生长曲线分析Lm928、Lm928△Lm4b_02324和CLm928△Lm4b_02324 3株菌的生长特性;对小鼠腹腔注射不同浓度的3株菌,观察感染后临床症状,统计死亡率,通过寇氏法计算3株菌对小鼠的半数致死量(LD50);将Lm928、Lm928△Lm4b 02324和CLm928△Lm4b_02324以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10分别感染HCMEC细胞,通过检测感染后不同时间细胞内的细菌数量分析各菌株的黏附与侵袭能力和胞内生存能力;提取野生株与缺失株DNA,使用prfA、mpl、hly等9对毒力相关因子的引物,利用实时荧光定量PCR技术测定其表达情况.[结果]分别成功获得了大小为1 209 bp的基因缺失株 Lm928△Lm4b_02324(野生株:2 517 bp)和 1 301 bp 的回补株 CLm928△Lm4b_02324(野生株:1 301 bp,条带一致),且缺失株传至15代后未出现回复突变现象;生长曲线结果显示,野生株、缺失株和回补株的生长状况差异不显著(P＞0.05);LD50测定结果显示,与野生型相比缺失株LD50显著降低(P＜0.05);黏附与侵袭力试验结果显示,缺失株的胞内存活数显著或极显著高于野生株与回补株(P＜0.05;P＜0.01);感染HBMEC细胞12 h内,缺失株的胞内活菌数显著高于野生株(P＜0.05).实时荧光定量PCR结果显示,Lm4b_02324基因的缺失使得prfA、inlA、plcA基因表达显著降低(P＜0.05);hly、actA、mpl、inlC基因表达极显著降低(P＜0.01).[结论]本研究结果表明,Lm4b 02324基因缺失会导致单增李斯特菌对小鼠的致死率升高并增强其在胞内增殖能力,为研究Lm4b_02324基因在单增李斯特菌致病中的作用奠定基础.