小檗碱抑制类风湿关节炎患者的成纤维样滑膜细胞的自噬并促进其凋亡:基于下调ROS/mTOR信号通路

目的 探究小檗碱(BBR)对类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLSs)凋亡/自噬失衡的调控作用及机制.方法 CCK-8法检测BBR对RA-FLSs的增殖抑制作用,实验设空白对照组、TNF-α(25 ng/mL)组、TNF-α+BBR(10、20、30、40、50、60、70、80μmol/L)组,Annexin V/PI双染流式法和JC-1免疫荧光染色检测BBR对RA-FLSs凋亡的影响,Western blot检测BBR对RA-FLSs自噬和凋亡相关蛋白表达水平的影响.进一步增加自噬诱导剂RAPA和自噬抑制剂氯喹(CQ)作为对照,激光共聚焦检测mCherry-EGFP-LC3B观察自噬流变化;并设置活性氧(ROS)模拟物H2O2和ROS抑制剂NAC观察BBR对ROS、mTOR、p-mTOR水平的影响.结果 CCK-8结果显示BBR可呈时间和浓度依赖性抑制RA-FLSs增殖活力,流式和JC-1染色结果显示BBR(30μmol/L)可显著增加RA-FLSs凋亡率(P<0.01),降低线粒体膜电位(P<0.05).Western blot结果显示BBR处理后Bcl-2/Bax(P<0.05)和LC3B-Ⅱ/Ⅰ(P<0.01)的比值降低,p62蛋白表达升高(P<0.05).mCherry-EGFP-LC3B自噬流检测结果也显示,BBR可阻断自噬流.免疫荧光结果证实BBR显著降低TNF-α诱导后ROS水平,上调自噬调控蛋白p-mTOR表达水平(P<0.01),且受ROS水平调控,合用RAPA可显著降低BBR对RA-FLSs的促凋亡作用(P<0.01).结论 BBR可能是通过调控ROS-mTOR抑制RA-FLSs自噬,促进其凋亡.