旋毛虫新生幼虫可溶性抗原的免疫蛋白组学分析

目的 鉴定能被旋毛虫感染血清识别的新生幼虫蛋白,为抗新生幼虫疫苗筛选候选抗原.方法 从感染旋毛虫的BALB/c小鼠肠道收集成虫,培养后收集新生幼虫,制备新生幼虫可溶性性抗原,通过蛋白质免疫印迹(Western blotting)筛选出能被旋毛虫感染小鼠血清识别的新生幼虫可溶性抗原蛋白带进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定,并与Uniprot数据库中的旋毛虫数据进行比对,利用生物信息学在线网站分析所鉴定的旋毛虫蛋白的理化性质,使用WEGO在线软件对匹配的蛋白进行基因本体(GO)分类.收集旋毛虫肌幼虫、肠道感染性幼虫(感染后6h)、成虫(感染后2d)和新生幼虫等不同发育期的虫体,提取虫体总RNA,反转录为cDNA.qPCR扩增旋毛虫C型凝集素(CTL)、钙网蛋白(CRT)、锌指蛋白(ZFP)和丙酮酸激酶(PK)基因,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因为内参,以肌幼虫的相对转录水平为对照,比较4个旋毛虫基因在不同发育期的相对转录水平.不同发育期相对转录水平的比较采用单因素方差分析.结果 Western blotting结果显示,新生幼虫可溶性抗原的11条蛋白条带中有4条被旋毛虫感染血清识别,相对分子质量分别为Mr 99 700、79 600、68 900和46 000;LC-MS/MS鉴定出353种旋毛虫蛋白,其中166种蛋白(47.0％)为Mr40 000～70 000,182种蛋白(51.8％)的等电点为5～6,31种蛋白有信号肽,58种蛋白有跨膜结构域.GO分析结果显示,353种旋毛虫蛋白中,285种蛋白有功能注释,其中177种蛋白(62.1％)具有催化活性,192种蛋白(67.4％)具有结合活性,158种蛋白(55.4％)参与代谢过程,149种蛋白(52.3％)参与细胞转化过程.qPCR结果显示,以旋毛虫肌幼虫的相对转录水平为对照,肠道感染性幼虫、成虫和新生幼虫的CTL基因相对转录水平分别为140.99％、90.99％和65.71％(F=1 875.105,P＜0.01),CRT 基因分别为 79.33％、41.59％和 58.58％(F=2 192.665,P＜0.01),ZFP 基因分别为 64.93％、105.36％和 126.74％(F=475.836,P＜0.01),PK 基因分别为 73.93％、98.09％和 43.19％(F=1 373.743,P＜0.01).结论 鉴定获得能被旋毛虫感染血清识别的新生幼虫蛋白353种,其参与了旋毛虫生长发育、免疫逃避及侵袭宿主等过程,有可能成为抗新生幼虫疫苗的候选靶分子.