短链脱氢酶Lvchun的分子改造及其在氯霉胺合成中的应用

2-氨基-1-(4-硝基苯基)-1,3-丙二醇俗称氯霉胺(ANP),由于具有两个手性中心,且结构中的O原子和N原子有良好的配位能力,具有广泛的应用价值.针对化学合成法存在生产成本高、原子经济性低、环保压力大等诸多缺点,旨在通过化学水解法与生物催化法相结合的方式,构建以对硝基-α-乙酰氨基-β-羟基苯丙酮(p-NAH)为底物合成(1R)-ANP的新途径.首先采用化学法水解p-NAH制备1-(4-硝基苯基)-2-氨基-3-羟基苯丙酮(AHNA),并筛选对水解产物具有催化活性的羰基还原酶,通过分子改造提高该酶的催化活性,并对突变体mut-V112Y的酶学性质进行研究;然后构建mut-V112Y与甲酸脱氢酶的双酶共表达及融合表达重组菌株,并对重组菌株的催化效率进行比较;最后优化催化反应条件,并进行制备反应.结果表明,化学法可水解p-NAH生成AHNA,筛选到的短链脱氢酶Lvchun可催化AHNA生成(1R)-ANP,通过对该酶进行定点突变获得了催化效率提高3.47倍的突变体mut-V112Y,其最适温度为30℃,最适pH为7.5,具有良好的温度和pH稳定性.成功构建了 mut-V112Y和甲酸脱氢酶CbFDH的双酶共表达和融合表达重组菌株,通过比较发现共表达菌株mut-V112Y-CbFDH的催化效率最高.通过优化催化反应条件,最终可在最适条件下反应30 min催化50 mmol/L AHNA生成14.56 mmol/L(1R)-ANP,收率为29.12％.化学水解法与生物催化法相结合的方式可有效地催化p-NAH合成(1R)-ANP,该方法为合成光学纯的ANP提供了新途径.