兔多杀性巴氏杆菌和兔出血症病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立兔多杀性巴氏杆菌(Pm)和兔出血症病毒(RHDV)的双重PCR检测方法,本研究根据Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,设计2对特异性引物,经PCR分别扩增Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,构建重组质粒pMD-Pm和pMD-RHDV,并经菌液PCR和测序鉴定后作为重组质粒标准品.经各反应条件优化后初步建立了检测Pm和RHDV的双重PCR方法.反应条件优化结果显示,该方法的最适退火温度为59℃,扩增kmt1和VP60基因的最优引物浓度均为0.5 μL(10 μmol/L).对Pm和RHDV及其他病原包括兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种相关病原的特异性试验结果显示,除Pm和RHDV有特异性扩增条带外,其余相关病原均无扩增条带,特异性较强.将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后作为模板,经该双重PCR方法扩增.结果显示,该方法对pMD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL,对pMD-RHDV的检测限为1260拷贝/μL,敏感性较高;对两种病原的DNA和cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致,重复性较好.对100份临床患病兔肺脏样品的检测结果显示,Pm和RHDV的阳性率分别为13％(13/100)和7％(7/100),二者混合感染率为37％(37/100),与已报道的Pm和RHDV单一PCR方法的检测结果均一致.表明该方法检测的准确性较高,可以用于临床样品的检测.本研究建立的同时快速检测Pm和RHDV的双重PCR方法为临床这两种病的诊断提供了技术支持.