犬圆环病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立了犬圆环病毒(canine circo virus,CanineCV)EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法.用PCR方法克隆CanineCV Rep基因中的高保守区,扩增的目的片段大小为217 bp,将其克隆至pMD18-T载体上,构建PCR检测阳性参考质粒,并用阳性参考质粒,进行各项反应条件优化.建立的标准曲线呈现出较高拟合性的线性回归,R2值为0.999 5;该方法检测灵敏度为3.88×101 copies/μL;在重复性试验中,组内和组间重复变异系数均小于2％,表明该方法具有良好的重复性;该方法对犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬流感病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型、犬冠状病毒等犬常见病原的检测均无交叉反应;临床样本检测表明,所建立的EvaGreen实时荧光定量PCR对CanineCV的阳性检出率为2.82％(5/177),高于普通PCR检测的CanineCV阳性率1.13％(2/177).本研究成功建立了 一种用于快速检测CanineCV的EvaGreen qPCR方法,该方法安全且具有较好的特异性、敏感性和重复性,可作为CanineCV感染的病原学检测工具.