限制性核酸内切酶Asc Ⅰ蛋白质的表达纯化、酶活测定及小角散射结构解析

限制-修饰系统(RMS)是细菌为了防御外来DNA入侵而进化产生的一种保护机制.RMS系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型.Asc Ⅰ是一种Ⅱ型限制性核酸内切酶,能识别8-bp DNA基序.尽管Asc Ⅰ已经被广泛应用于分子克隆研究中,然而目前尚无关于Asc Ⅰ蛋白质的表达、纯化以及结构机制等方面的研究报道.本研究基于大肠杆菌重组表达体系建立了 Asc Ⅰ重组蛋白质的高效表达和纯化方法,从每升细菌培养物中可获得约2.5 mg纯度大于95％的Asc Ⅰ蛋白质.进一步的酶学性质研究表明,Asc Ⅰ酶切反应的最适温度是37℃,最适pH为7.5～8.5,反应依赖于Mg2+和Mn2+等二价金属离子.基于小角X射线散射(SAXS)分析技术,我们还建立了AscⅠ蛋白质及其与底物DNA复合物在溶液状态下的三维空间模型,并结合点突变对该模型进行了验证.总之,本研究对Asc Ⅰ蛋白质的重组表达、纯化、酶活性质以及结构机制进行了比较系统地研究,为了解RMS系统的工作机制提供了结构基础,同时也为Asc Ⅰ作为分子克隆工具酶的进一步开发和改造提供了理论依据.