MuRF2、PPARγ1和Ub重组质粒的构建及鉴定

目的 构建过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 亚型1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma isoform 1,PPARγ1)、泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(ubiquitin ligase muscle ring finger protein 2,MuRF2)和泛素(ubiquitin,Ub)的重组质粒并进行鉴定.方法 根据MuRF2、PPARγ1和Ub的cDNA序列及GV146和GV417载体质粒上的多克隆位点设计目的基因克隆引物.XhoI/EcoRI内切酶分别双酶切PPARγ1目的DNA与GV146载体;NheI/BamHI内切酶分别双酶切MuRF2和Ub目的DNA与GV417载体.用连接酶连接双酶切后的目的DNA和载体,导入大肠杆菌经筛选获得重组质粒.PCR鉴定重组克隆后进行DNA测序.转染HEK 293T细胞后,于荧光显微镜下观察转染效率;免疫共沉淀实验后用Western blot检测蛋白的表达及蛋白质相互作用.结果 以合成的PPARγ1、Ub、MuRF2的引物分别对PPARγ1、Ub和MuRF2的菌落进行PCR扩增,产物大小分别为943、451和1154 bp,与预期结果一致.测序结果与目的基因序列进行比对分析,证实成功构建出PPARγ1、Ub和MuRF2的重组质粒.在HEK 293T细胞中共转染His-MuRF2、HA-Ub、PPARγ1重组质粒,荧光显微镜观察结果提示重组质粒成功转染.免疫共沉淀试验后用Western blot检测可见PPARγ1、MuRF2和Ub蛋白的有效表达,且验证了MuRF2介导PPARγ1发生泛素化修饰反应.结论 成功构建PPARγ1、MuRF2和Ub的重组质粒,且三种质粒在HEK 293T细胞中有效表达,验证了MuRF2介导PPARγ1发生泛素化修饰反应.