奶牛乳房炎三种主要链球菌多重PCR检测方法的建立

链球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原菌,其中无乳链球菌(S.agalactiae)、停乳链球菌(S.dysgalac-tiae)和乳房链球菌(S.uberis)是奶牛乳房炎主要的致病性链球菌.为同时、快速地检测牛奶样品中这3种重要链球菌,本研究根据无乳链球菌Sip基因、停乳链球菌Mig基因及乳房链球菌pauA基因设计特异性引物,同时以细菌16SrRNA基因为内参,建立了多重PCR检测方法,并进行条件优化.结果显示,该方法最佳退火温度为58℃,最佳扩增循环数为25个循环,本方法同时检测无乳链球菌、停乳链球菌及乳房链球菌时,检测限分别为1×103 CFU/mL、1×103 CFU/mL及1×104 CFU/mL,灵敏性高.该方法对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌等10种菌均无交叉反应,特异性好.模拟样品结果显示,当奶样中3种菌的初始浓度均为1 CFU/mL时,37℃增菌6 h即可检出乳房链球菌,增菌8 h以上3种菌可全部检出.结果表明,该多重PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏性,对同时快速检测牛奶中无乳链球菌、停乳链球菌及乳房链球菌具有重要意义,也为奶牛乳房炎的监管、诊治提供了技术支持.