miR-99a-5p在结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞中的免疫调控作用

目的:初步探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染THP-1细胞内特异miRNA在宿主抗结核免疫中的作用.方法:提取MTB感染及未感染THP-1细胞RNA,基于Illumina NovaSeq6000二代测序平台检测THP-1细胞内miRNA表达谱.采集4名健康受试者6 ml外周血并分离人原代巨噬细胞.应用实时荧光PCR(qRT-PCR)技术验证MTB感染THP-1细胞内特异miRNA并检测人原代巨噬细胞中靶标miRNA的表达水平.构建miRNA过表达载体,经慢病毒转染THP-1巨噬细胞获得稳定的过表达细胞株,使用qRT-PCR检测H37Rv感染的miRNA过表达细胞及对照空载体细胞中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)及γ-干扰素(IFN-γ)表达水平.结果:从16个二代测序结果表达差异明显的miRNA分子中选取既往未作研究且差异最为明显的miR-99a-5p(P=0.021)作为研究靶基因.通过qRT-PCR在THP-1细胞及原代巨噬细胞中验证,发现miR-99a-5p在THP-1感染组和原代巨噬细胞内的表达量(分别为0.482±0.148和0.433±0.072)均明显低于未感染组(1.536±0.290和 1.113±0.218),差异均有统计学意义(t=6.476,P＜0.001;t=3.167,P=0.019).MTB感染 miR-99a-5p 过表达细胞后24h的菌落形成单位(CFU)[64.0×104(52.0×104,87.0×104)]明显高于MTB感染的对照空载体细胞内CFU[17.0×104(16.0×104,24.0×104)],差异有统计学意义(Z=-2.323,P=0.029).与MTB感染的对照空载体细胞相比,MTB感染的miR-99a-5p过表达细胞内TNF-α及IFN-γ的mRNA相对表达水平分别由1.018±0.310 和 1.687±0.135 下降至 0.740±0.001 和 0.631±0.374,差异均有统计学意义(t=4.631,P=0.010;t=3.349,P=0.010).结论:miR-99a-5p可抑制TNF-α及IFN-γ的释放,促进MTB在巨噬细胞内的生长.MTB感染后宿主miR-99a-5p的下调表达可能在宿主抗结核感染免疫中发挥重要作用.