稳定敲除Mcart-1下调RAW264.7巨噬细胞增殖能力和氧化磷酸化水平

目的 基于CRISPR/Cas9原理构建Mcart-1稳定敲除的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株RAW264.7,检测其细胞增殖能力和能量代谢水平.方法 用Cas9慢病毒和sgRNA慢病毒分两步感染RAW264.7巨噬细胞,并挑选单克隆细胞:qPCR和Western blot检测Cas9表达水平和Mcart-1敲除效果;单细胞测序分析突变位点;细胞能量代谢分析仪Seahorse检测细胞耗氧速率(OCR)和能量代谢表型;试剂盒测定细胞内总ATP含量;细胞计数仪计数和羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色检测细胞增殖.结果 成功构建Mcart-1稳定敲除的RAW264.7细胞株(记为Mcart-1-/--RAW264.7);该细胞株中Mcart-1发生移码突变;与野生型RAW264.7细胞系(记为RAW264.7)相比,Mcart-1-/--RAW264.7细胞氧气消耗速率(OCR)下降,胞外酸化速率(ECAR)升高;与RAW264.7细胞相比,Mcart-1-/--RAW264.7细胞内总ATP含量下降(P<0.05),线粒体ATP产生速率下降(P<0.01),而糖酵解ATP产生速率升高(P<0.01);与RAW264.7细胞相比,Mcart-1---RAW264.7细胞增殖能力下降(P<0.001).结论 稳定敲除Mcart-1后RAW264.7细胞增殖能力和氧化磷酸化水平均下降.该细胞株可作为探索肿瘤微环境细胞功能的重要工具.