菘蓝查尔酮异构酶基因的克隆与体外酶活鉴定

查尔酮异构酶是高等植物黄酮类化合物生物合成中的关键限速酶,决定了植物体内黄酮类化合物的产生.该研究从菘蓝的不同部位中提取RNA,反转录为cDNA,并设计带有酶切位点的特异性引物,克隆得到1个菘蓝查尔酮异构酶基因,命名为IiCHI.该基因全长756 bp,含有1个完整的开放阅读框,编码251个氨基酸.通过同源比对显示IiCHI与拟南芥Arabi-dopsis thaliana的CHI蛋白亲缘关系较近,并且具有查尔酮异构酶典型的活性位点,系统发育树分析显示IiCHI归属于Ⅰ型CHI.构建原核表达载体pET28a-IiCHI并进行诱导表达,纯化后获得IiCHI的重组蛋白.体外酶活性检测实验显示IiCHI重组蛋白可以把柚皮素查尔酮催化生成柚皮素,而不能把异甘草素催化生成甘草素.实时荧光定量PCR结果显示菘蓝中IiCHI在地上部分的表达量明显高于地下部分,其中地上部分在花中表达量最高,叶与茎次之,在地下部分的须根、根的皮部与木质部几乎不表达.该研究为进一步探讨菘蓝中查尔酮异构酶的功能及其在黄酮类化合物的生物合成研究中提供了参考.