肿瘤坏死因子α/胞外信号调节激酶途径对HaCaT细胞迁移能力及小鼠全层皮肤缺损的影响

目的:探讨肿瘤坏死因子α（TNF-α）/胞外信号调节激酶（ERK）途径对HaCaT细胞迁移能力及小鼠全层皮肤缺损的影响。方法:采用实验研究方法。按照随机数字表法（下同）将HaCaT细胞分为常氧组和低氧（氧气体积分数为1%，下同）条件下培养的低氧组。培养24 h后，采用微阵列置信度分析软件SAM 4.01筛选出2组细胞的显著差异表达基因，通过京都基因和基因组百科全书对信号通路中每条基因数目的显著性进行分析以筛选差异显著的信号通路，样本数为3。另取HaCaT细胞，在低氧条件下培养0（即刻）、3、6、12、24 h，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测细胞分泌TNF-α的水平，样本数为5。另取HaCaT细胞，分为常氧组、单纯低氧组和加入FR180204（一种ERK抑制剂）并置于低氧条件下培养的低氧+抑制剂组，培养3、6、12、24 h，采用划痕试验检测细胞的迁移能力，样本数为12。另取HaCaT细胞，在低氧条件下培养0、3、6、12、24 h，采用蛋白质印迹法检测细胞中磷酸化核因子κB（p-NF-κB）、磷酸化p38（p-p38）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、神经钙黏素和上皮钙黏素的表达，样本数为3。取64只6~8周龄雄性BALB/c小鼠，在小鼠背部制作全层皮肤缺损创面模型后，将其分为空白对照组和用FR180204处理的抑制剂组，每组32只，分别作相应处理。伤后0、3、6、9、12、15 d，观察创面情况并计算其愈合率（样本数为8）。伤后1、3、6、15 d，采用苏木精-伊红染色观察创面中新生血管生成、炎症细胞浸润和表皮新生情况，采用Masson染色观察创面中胶原沉积情况，采用蛋白质印迹法检测创面组织中p-NF-κB、p-p38、p-ERK1/2、神经钙黏素和上皮钙黏素的表达（样本数为6），采用免疫组织化学法检测创面中Ki67阳性细胞数和血管内皮生长因子（VEGF）吸光度值（样本数为5），采用ELISA法检测创面组织中白细胞介素6（IL-6）、IL-10、IL-1β和CCL20的蛋白表达（样本数为6）。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析、析因设计方差分析、Tukey检验、LSD检验和独立样本 t检验。 结果:培养24 h后，与常氧组相比，低氧组细胞中上调了7 667个基因，下调了7 174个基因；在前述差异表达基因中，TNF-α信号通路有显著的变化（ P<0.05）且基因数目多。低氧条件下，与0 h的（1.9±0.3）pg/mL相比，TNF-α表达量仅在细胞培养24 h［（11.1±2.1）pg/mL］时显著增加（ P<0.05）。与常氧组相比，单纯低氧组细胞培养6、12、24 h的迁移能力均明显增强（ t值分别为2.27、4.65、4.67， P<0.05）；与单纯低氧组相比，低氧+抑制剂组细胞培养3、6、12、24 h的迁移能力均明显减弱（ t值分别为2.43、3.06、4.62、8.14， P<0.05）。低氧条件下，与培养0 h相比，p-NF-κB、p-ERK1/2、神经钙黏素表达量在细胞培养12、24 h时均明显升高（ P<0.05），p-p38表达量在细胞培养3、6、12、24 h时均明显升高（ P<0.05），上皮钙黏素表达量在细胞培养6、12、24 h时均明显降低（ P<0.05）；其中，p-ERK1/2、p-NF-κB和上皮钙黏素在细胞中的表达量呈时间依赖性。与空白对照组相比，抑制剂组小鼠伤后3、6、9、12、15 d创面愈合率均明显降低（ P<0.05）；抑制剂组小鼠创缘周围在伤后3、6、15 d有更多炎症细胞浸润，尤其在伤后15 d，创面中可见大量组织坏死且新生表皮层不连续，同时胶原合成和新生血管减少；抑制剂组小鼠创面中p-NF-κB表达量在伤后3、6 d均明显降低（ t值分别为3.26、4.26， P<0.05）但在伤后15 d明显升高（ t=3.25， P<0.05），p-p38和神经钙黏素表达量在伤后1、3、6 d均明显降低（ t值分别为4.89、2.98、3.98，9.51、11.69、4.10， P<0.05），p-ERK1/2表达量在伤后1、3、6、15 d均明显降低（ t值分别为26.69、3.63、5.12、5.14， P<0.05），上皮钙黏素表达量在伤后1 d明显降低（ t=20.67， P<0.05）但在伤后6 d明显增加（ t=2.90， P<0.05）；抑制剂组小鼠创面中Ki67阳性细胞数和VEGF的吸光度值在伤后3、6、15 d均明显减少/降低（ t值分别为4.20、7.35、3.34，4.14、3.20、3.73， P<0.05）；抑制剂组小鼠创面组织中IL-10表达量在伤后6 d明显降低（ t=2.92， P<0.05），IL-6表达量在伤后6 d明显增加（ t=2.73， P<0.05），IL-1β表达量在伤后15 d显著增加（ t=3.46， P<0.05），CCL20表达量在伤后1、6 d均明显降低（ t值分别为3.96、2.63， P<0.05）但在伤后15 d显著增加（ t=3.68， P<0.05）。 结论:TNF-α/ERK途径可促进HaCaT细胞迁移并通过影响小鼠全层皮肤缺损创面中炎症因子和趋化因子的表达调控创面愈合。