鸡毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子的克隆、表达与虫体内定位

顶复门原虫的AP2结构域蛋白(ApiAP2)可能是调控虫体生长发育的转录因子.本研究旨在克隆、表达毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子,检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位.以毒害艾美耳球虫第3代裂殖子的总RNA为模板,RT-PCR扩增毒害艾美耳球虫EnApiAP2基因后,连接至pMD18-T载体,测序后构建pET28a(+)-EnApiAP2表达载体,转化至表达菌BL21(DE3),重组菌经测序鉴定后诱导表达,并纯化复性重组蛋白.用重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗rEnApiAP2多克隆抗体.利用多克隆抗体,分别用Western blot和间接免疫荧光试验检测裂殖子中天然EnApiAP2蛋白及其定位.最后,应用荧光定量PCR分析EnApiAP2基因在第2、3代裂殖子中的转录水平.结果显示,该基因全长1 830 bp,编码610个氨基酸,含有一个AP2结构域,预测分子质量67.69 ku;重组蛋白大小约为74 ku,主要以包涵体形式存在,可以被6×HIS标签单抗、鸡抗毒害艾美耳球虫康复血清和鸡抗柔嫩艾美耳球虫康复血清识别;在第3代裂殖子中检测到天然EnApiAP2蛋白,分子质量约为85 ku;EnApiAP2蛋白定位在第2、3代裂殖子细胞核内;第3代裂殖子EnApiAP2转录水平显著高于第2代裂殖子(P＜0.01).成功克隆、表达了 EnApiAP2基因,证实该基因表达的蛋白定位在裂殖子的细胞核内,为进一步研究EnApiAP2蛋白的转录因子功能奠定了基础.