酶联免疫吸附法快速检测畜禽产品中西马特罗药物残留

目的 建立一种以单链抗体为基础的酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)快速检测畜禽产品中西马特罗(cimaterol,CIM)药物残留.方法 以重氮化法合成的西马特罗完全抗原CIM-牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)免疫新西兰大白兔,用兔脾细胞总RNA反转录合成cDNA第一链,设计引物扩增兔源抗体重链可变区(heavy chain variable region,VH)和轻链可变区(light chain variable region,VL),通过45 bp的连接肽(Linker)使用新型重叠延伸聚合酶链式反应技术(splicing by overlap extension polymerase chain reaction,SOE-PCR)连接成VH-Linker-VL并大量制备;利用噬菌体表面展示技术将单链抗体(single-chain variable fragment,ScFv)片段与噬菌体展示载体pCANTAB-5e连接,电转化至大肠杆菌TG1感受态细胞,得到兔源噬菌体ScFv抗体库.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)判断是否偶联成功,用紫外(ultraviolet,UV)扫描及基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption tandem time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)测定人工抗原的偶联比.用ELISA测定免疫兔血清质量.鉴定合成抗体库并对抗体库进行4轮淘选,取最优的CIM-ScFv进行氨基酸序列分析.结果 CIM-BSA及CIM-鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)偶联比分别为8:1及10:1,免疫血清校价为1:32000,半数抑制浓度为9.77 ng/mL,标准曲线的拟合度为0.997.抗西马特罗兔源噬菌体ScFv免疫库的插入率为92％,库容为1×1010 pfu,多样性为83.3％,经淘选获得一株与CIM有结合活性的噬菌体ScFv菌.结论 西马特罗完全抗原的合成效果良好,可用于建立西马特罗检测方法,兔源噬菌体抗体库为快速获得CIM单链抗体奠定基础,为西马特罗快速检测提供了新思路.