鸭肠炎病毒疫苗株UL41和UL40基因间隔区作为其复制非必需区的鉴定

为探寻鸭肠炎病毒(DEV)基因组中可插入外源基因的复制非必需区,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建重组质粒pX459-ul4140和含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的穿梭片段UL41-RFP-UL40,转染后拯救重组病毒,并对其进行噬斑纯化.通过PCR和荧光显微镜观察对重组病毒进行鉴定,结果显示,经拯救得到表达RFP的重组病毒rDEV-ul4140RFP;所有代次的rDEV-ul4140RFP在显微镜下均能观察到红色荧光,表明重组病毒中的RFP基因稳定存在.将rDEV-ul4140RFP和亲本病毒DEV疫苗株接种鸡胚成纤维细胞(CEFs)后,收集24 h、48 h、72 h、96 h的细胞和上清,检测TCID50并绘制生长曲线.结果显示,rDEV-ul4140RFP在CEF中的生长曲线和亲本DEV疫苗株无显著差异.利用SPF鸭对rDEV-ul4140RFP的免疫保护效果进行评价.攻毒保护实验结果显示,rDEV-ul4140RFP和亲本病毒DEV疫苗株均能对SPF鸭提供100％的免疫保护.本研究结果证实DEV基因组UL41和UL40基因间隔区可作为外源基因的插入位点,为以DEV为载体构建相关重组疫苗提供参考依据.