传染性喉气管炎病毒U L56蛋白在不同感染模式中的表达及其亚细胞定位分析

传染性喉气管炎病毒(ILTV)编码的UL56蛋白在进化上非常保守,其功能尚不清楚.为明确UL56蛋白在鸡胚肾(CEK)细胞和气管环(TOC)两种不同感染模式中的表达特征及其在HEK293T细胞中的亚细胞定位,本研究分别构建了野生型ILTV UL56的重组质粒pUL56(WT)、其关键结构域突变体的质粒pUL56(AY)(将UL56氨基酸序列中两个PY基序(PY motif)的脯氨酸(Pro,P)均突变为丙氨酸(Ala,A)及pUL56(△TMD)(删除UL56氨基酸序列中的跨膜域TMD),将这3个质粒分别转染DF-1细胞后均经western blot鉴定.结果显示,分别获得了约81 ku的特异性条带,表明野生型UL56及其突变体均获得了表达.以5 000 EID50/mL ILTV疫苗株K317分别感染CEK和TOC后不同时间,利用兔UL56多克隆抗体通过western blot检测UL56蛋白表达的变化.结果显示,UL56蛋白在两种不同感染模式中的表达特征明显不同.CEK中的UL56蛋白从感染后24h开始表达,48h达到高峰后逐渐下降;而TOC中UL56蛋白的表达量则持续上升,至感染后96h达到峰值.将pUL56(WT)、pUL56(AY)和pUL56(△TMD)分别转染HEK293T细胞后瞬时表达UL56蛋白及其突变体,经高尔基体标志蛋白58k的抗体孵育后,通过激光共聚焦试验观察UL56蛋白的亚细胞定位.结果显示UL56蛋白主要定位于高尔基体,且亚细胞定位不受其PY motif的影响而受其TMD的影响.本研究首次揭示了 ILTV感染细胞和离体组织后UL56蛋白表达的特征,并鉴定了影响其亚细胞定位的关键结构域,为后续探究该蛋白的分子作用机制和生物学功能奠定了实验基础.