利用实时荧光定量PCR和数字PCR检测鉴定水稻细菌性条斑病菌

白叶枯病和条斑病是水稻重要的细菌性病害.水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)属于同种下的2个致病变种.鉴别Xoo和Xoc对检疫和防控这2种病害至关重要.Xoo和Xoc中的铁-红酵母酸/铁-粪生素受体基因fhuE在进化过程中因不同程度地缺失而成为假基因.针对Xoc中有而Xoo中缺失的fhuE部分序列设计引物,筛选出Xoc特异引物XocFhuE-F(5'-ATCGAACGATGTCACCAGGG-3')和 XocFhuE-R(5'-AGAAACGTGCGGCCAGATAA-3').用 XocFhuE-F/XocFhuE-R能只从Xoc菌株中仅扩增出159 bp片段,并结合荧光染料建立了 SYBR Green实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和 EvaGreen微滴数字 PCR(digital PCR,dPCR)方法来检测鉴定Xoc.在 20 pL反应体系中加1 piL模板,qPCR检测菌悬液中Xoc的下限是1.6×104 CFU/mL,检测带菌种子中Xoc的下限是1.2×103 CFU/粒;dPCR检测菌悬液中Xoc的下限是1.6×103 CFU/mL,检测带菌种子中Xoc的下限是1.2×102 CFU/粒.综上所述,基于Xoc特异引物XocFhuE-F/XocFhuE-R建立的SYBR Green qPCR和EvaGreen dPCR为检疫Xoc和监测预警水稻条斑病提供了高效的检测方法.