不同月龄C57BL/6J小鼠耳蜗线粒体和NAD+水平比较

目的·研究不同月龄小鼠耳蜗中线粒体及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)水平的变化,探索年龄相关性听力下降可能的机制.方法·分别选取1月龄、4月龄、8月龄及12月龄4组C57BL/6J雄性小鼠各10只,采用听性脑干反应(auditory brain response,ABR)和畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emission,DPOAE)测定4组不同月龄小鼠听觉功能;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)比较4组不同月龄小鼠耳蜗中线粒体能量代谢相关基因Ndufb5(NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit B5)、Sdha(succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A)、Sdhc(succinate dehydrogenase complex subunit C)和Atp5b(ATP synthase,H+transporting mitochondrial F1 complex,beta subunit)的mRNA表达水平;通过免疫荧光染色分别观察1月龄和12月龄小鼠耳蜗毛细胞中的线粒体数量变化;通过透射电子显微镜(电镜)观察1月龄和12月龄小鼠耳蜗中内毛细胞、外毛细胞、螺旋神经节细胞及神经纤维中的线粒体形态结构;通过定量比色法检测并比较不同月龄小鼠耳蜗中的NAD+水平.结果·小鼠的ABR和DPOAE阈值呈现随月龄增长而升高的趋势,其中12月龄小鼠的ABR阈值在5.66～45.00 kHz的频率段较1月龄小鼠均显著升高(均P<0.01),DPOAE阈值在11.32～32.00 kHz的频率段较1月龄小鼠也显著升高(均P<0.01).与1月龄小鼠相比,4、8、12月龄小鼠中4个线粒体功能相关基因(Ndufb5、Sdha、Sdhc和Atp5b)mRNA的表达水平呈现随月龄增长而下降的趋势,并在8月龄开始与1月龄的差异有统计学意义(均P<0.05).免疫荧光染色结果显示12月龄小鼠耳蜗内毛细胞中的线粒体数量较1月龄明显减少.另外透射电镜在12月龄小鼠内毛细胞、螺旋神经节细胞及神经纤维中观察到空泡样变性的线粒体以及螺旋神经节细胞中出现较大的脂褐素.小鼠内耳NAD+水平呈现随月龄增长而下降的趋势,8月龄和12月龄小鼠NAD+水平较1月龄显著下降(均P<0.01).结论·随月龄增长,C57BL/6J小鼠外周听觉关键细胞的线粒体功能下降、结构异常,耳蜗NAD+水平下降,这与小鼠听力阈值随着月龄增长而下降的表现一致.