长链非编码RNA Gm35082-202对布鲁氏菌引起的细胞焦亡的影响

[目的]研究长链非编码RNA(lncRNA)Gm35082-202对布鲁氏菌侵染引起的细胞焦亡的影响,旨在为研究lncRNA参与布鲁氏菌引起的先天性免疫反应提供参考.[方法]在Ensemble数据库中查找并分析Gm35082-202在染色体上的位置、外显子等信息;采用RNAfold在线软件预测Gm35082-202的二级结构;通过KEGG、GO富集分析预测Gm35082-202功能;用牛种布鲁氏菌(S2308)以感染复数(MOI)为0.01侵染小鼠巨噬细胞(RAW264.7),在侵染不同时间点(0、4、8、12、24、36、48 h)收集细胞,用实时荧光定量PCR检测Gm35082-202的表达量;利用LncLocator网站预测Gm35082-202亚细胞定位,用实时荧光定量PCR检测Gm35082-202在细胞质、细胞核的表达;将 3 条 Gm35082-202 siRNAs(siRNA1、siRNA2 和 siRNA3)、siRNA NC 转染 RAW264.7 细胞,实时荧光定量PCR检测Gm35082-202的表达量,筛选干扰效率最高的siRNA进行后续试验.Gm35082-202-siRNA、Gm35082-202-siRNA-NC转染RAW264.7细胞24 h后,再用布鲁氏菌侵染,以PBS为空白对照组(PBS),只用布鲁氏菌侵染的细胞为侵染对照组(Bru).侵染24 h后收集PBS组、Bru组、Gm35082-202-siRNA组(Bru-siRNA)、Gm35082-202-siRNA-NC组(Bru-NC)细胞,用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测各组细胞中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Caspase-11、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-18的相对表达量,用ELISA法检测各组上清液中细胞因子IL-1β、IL-18分泌水平;通过菌落计数,比较各组布鲁氏菌的胞内生存能力.[结果]基因结构分析表明,Gm35082-202是大小为525 nt的lncRNA(Trianscript ID:ENSMUST00000208164.2),含有2个外显子,位于小鼠7号染色体(Chr7:100 324 295～100 326 967),其二级结构含有多个茎环及多分枝内部环结构;KEGG信号通路富集分析表明,Gm35082-202主要参与NOD样受体、钙调节以及细胞因子信号通路的调控;GO功能分析结果显示,Gm35082-202功能主要涉及DNA转录、线粒体组分以及金属离子结合.布鲁氏菌侵染RAW264.7细胞后,与0 h组相比,侵染4和8 h时Gm35082-202表达量显著增加(P＜0.05),侵染12、24、36和48 h时表达量极显著增加(P＜0.01);亚细胞定位预测结果表明,Gm35082-202主要分布于细胞核(58.3％),其次是细胞质(35.1％),布鲁氏菌侵染RAW264.7细胞0 h时,Gm35082-202在细胞核中分布比例为63.4％,在侵染4、24和36 h Gm35082-202在细胞核中的分布减少,分别为24.5％、29.6％和30.4％.Gm35082-202-siRNA1、Gm35082-202-siRNA3 均极显著降低 Gm35082-202 的表达量(P＜0.01),Gm35082-202-siRNA1 干扰效率最高.与 Bru 组相比,Bru-siRNA 组中 NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、IL-1 β 和 IL-18 基因的表达量均极显著降低(P＜0.01),NLRP3和Caspase-11蛋白的表达量显著降低(P＜0.05),Caspase-1蛋白的表达量极显著降低(P＜0.01);细胞上清中IL-1β和IL-18分泌水平均极显著下降(P＜0.01);Bru-siRNA组胞内布鲁氏菌数显著升高(P＜0.01).[结论]布鲁氏菌通过上调Gm35082-202表达促进巨噬细胞焦亡,该结果可为进一步探究布鲁氏菌侵染时Gm35082-202参与调控宿主细胞焦亡的分子机制提供参考.