秦川牛PDHB基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

[目的]旨在通过构建秦川牛丙酮酸脱氢酶β 亚基(pyruvate dehydrogenaseβsub-unit,PDHB)基因的重组腺病毒载体,为研究PDHB基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的功能做准备.[方法]根据牛PDHB基因mRNA序列(GenBank Accession No.NM_001035435)设计引物,克隆该基因的编码区(coding sequence,CDS)序列.测序验证后将其重组到穿梭载体pAdTrack-CMV上,经PmeⅠ线性化后,转化到含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的E.coli BJ5183感受态细胞中进行同源重组,以获得重组质粒pAd-PDHB.再将经PacⅠ酶切线性化的pAd-PDHB转染到HEK 293 A细胞中,进行病毒包装并扩增高滴度病毒Ad-PDHB,绿色荧光蛋白(GFP)标记法测定病毒滴度.将高浓度的Ad-PDHB病毒感染牛肌内前体脂肪细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PDHB的表达量.[结果]经测序验证,实验克隆获得的牛PDHB基因CDS与数据库GenBank收录的序列一致.将PDHB基因CDS与穿梭载体pAdTrack-CMV重组并转染HEK 293 A细胞后成功获得了重组腺病毒Ad-PDHB,其滴度为1.66×109 PFU/mL.腺病毒Ad-PDHB侵染牛肌内前体脂肪细胞后,PDHB在mRNA的表达水平比对照组高25.5倍.[结论]成功克隆秦川牛PDHB基因,并构建重组腺病毒质粒pAd-PDHB,获得能够在牛肌内前体脂肪细胞中过表达PDHB基因的高滴度重组腺病毒Ad-PDHB.