Otimização da metodologia de sequenciamento do gene tp53 para a detecção de mutações em neoplasias hematológicas

O objetivo do trabalho foi otimizar o procedimento técnico do exame sequenciamento somático do gene TP53 para menor tempo de processamento. A presença de mutações patogênicas em TP53 é um indicador de mau prognóstico em neoplasias hematológicas em geral. Além disso atualmente, existem tratamentos específicos, em casos de leucemia linfóide crônica, que estão indicados especificamente para pacientes portadores de mutações patogênicas em TP53. Para a otimização do tempo de processamento técnico do preparo de biblioteca para sequenciamento de nova geração (NGS) do gene TP53, foram realizadas algumas alterações na metodologia em rotina: A) substituição de reagentes de amplificação por um mix de amplificação pronto; B) diminuição do número de reações de amplificação de 07 para 03 reações cobrindo todas as porções codificantes e junções éxon-íntron do gene; C) substituição da visualização de bandas dos produtos de amplificação pela quantificação dos produtos por fluorometria. O preparo de biblioteca foi realizado com o Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina) de acordo com instruções do fabricante, e o sequenciamento foi realizado na plataforma Illumina, 300 ciclos paired-end. A análise bioinformática foi realizada com pipeline interno, desenvolvido e disponível na plataforma Varsomics. Para a validação das melhorias foram selecionadas 26 amostras com resultado prévio de sequenciamento do gene TP53 por NGS. Das 26 amostras: 20 foram destinadas a acurácia do teste e para a reprodutibilidade, 3 amostras em triplicata interensaio e 3 amostras em triplicata intraensaio. Para o teste de sensibilidade foram selecionas 03 amostras, as quais foram misturadas em um pool diluindo a frequência alélica das variantes para um range de 2 a 15% e o pool foi testado 20 vezes para determinação do limite de detecção do teste. As alterações aplicadas na metodologia levaram a diminuição do tempo de processamento técnico: a) substituição do mix amplificação de 15 para 5 minutos; B) redução no número de reações de 30 pra 10 minutos; C) substituição do gel de agarose pela quantificação dos produtos por fluorometria de 120 minutos por 10 minutos. Na acurácia 20/20 (100%) das amostras apresentaram resultados concordantes com os resultados prévios, sendo identificadas nessas amostras 100% das variantes esperadas. Os testes de reprodutibilidade intra e interensaio apresentaram 100% de correlação das variantes encontradas no gene TP53, reproduzidas em triplicata 3 intra e 3 interensaio. A sensibilidade ficou mantida em 5% de frequência alélica, considerando as 20 replicatas do pool. Os dados da validação foram analisados para estudo de: acurácia, reprodutibilidade intraensaio, reprodutibilidade interensaio e sensibilidade para o teste de Sequenciamento do gene TP53. As alterações realizadas no método apresentaram mesma performance de qualidade em comparação com método anterior, com menor tempo de execução do teste. As otimizações aplicadas na técnica foram efetivas permitindo maior agilidade no processamento técnico da amostra para a identificação de variantes somáticas do gene TP53.