抗菌肽MPX对肠出血性大肠杆菌的体外抑菌作用及其作用机制的初步研究

为研究抗菌肽MPX(Mastoparan-X)对肠出血性大肠杆菌(EHEC)的体外抑菌作用及作用机理.本研究通过琼脂扩散法、最小抑菌浓度(MIC)的测定、杀菌曲线的绘制以及扫描电镜观察MPX对EHEC的抑菌效果,结果显示MPX对EHEC的抑菌圈直径为9.7 mm,大于抗菌肽PR39但小于恩诺沙星(Enro);其对EHEC的MIC为31.25 μg/mL;杀菌曲线结果显示,4MICMPX作用6h后,EHEC菌液OD600nm值降至0.1,极显著低于阴性对照组(只加入ddH2O的EHEC,下同)(P＜0.01),活菌数量降至阴性对照的千分之一(P＜0.05),且4MICMPX的抑菌效果优于抗菌肽PR39与Enro;电镜观察结果显示,MPX作用后的菌体明显变小,细菌内容物渗漏.MPX稳定性试验结果显示,酸、碱、温度、一价阳离子等对MPX的抑菌效果影响较小,二价阳离子极显著抑制MPX的抑菌活性(P＜0.01).上述结果表明,MPX在体外有较强的抑菌效果,且稳定性较强.采用BCA法测定不同浓度MPX(0.5 MIC、1 MIC、2 MIC)作用后的EHEC上清中的蛋白含量;采用SYTO 9/PI染色后经激光共聚焦显微镜观察上述不同浓度MPX作用后的EHEC菌体荧光颜色;采用苯基萘胺(NPN)探针、碘化丙啶(PI)染料和3,3-二丙基硫代二碳氰碘化物[DiSC3(5)]探针分别检测不同浓度MPX(1 MIC、2 MIC、4 MIC)作用后的EHEC菌液的荧光强度,以分析MPX对EHEC细胞膜通透性的影响.BCA结果显示,1 MIC及2 MIC MPX作用后的菌液上清蛋白含量均显著高于阴性对照组(P＜0.05);激光共聚焦试验结果显示,与阴性对照组相比,只有2 MIC MPX作用后的EHEC中的红色荧光明显增多;NPN探针和DiSC3(5)探针检测结果显示,不同浓度MPX作用后(0～2 min)EHEC的荧光强度均明显增强,其后不再变化;PI染料检测结果显示,不同浓度MPX作用后(0～4min)EHEC的荧光强度均明显增强,其后逐渐降低.上述结果表明,MPX可以破坏EHEC的外膜和细胞膜,使膜的通透性增加,进而导致细菌死亡,且该作用与MPX的浓度基本呈正相关.分别利用结晶紫染色法检测和电镜观察MPX对EHEC生物被膜(BF)形成的影响,结果显示,与阴性对照相比,1 MIC～4MIC的MPX均极显著抑制EHECBF的形成(P＜0.01、P＜0.001),且该抑制作用与MPX浓度呈正相关;电镜观察结果显示,与阴性对照组相比,1 MIC MPX作用后的EHEC BF结构松散且稀疏.以上结果表明,MPX可以通过抑制EHEC BF的形成而发挥抑菌作用.本研究为研发新型抗菌药物奠定了实验基础.