野生型ZNF750负调控E2F2转录活性抑制CAL-27细胞增殖迁移的机制

目的 研究锌指蛋白750(ZNF750)调控E2F转录因子2(E2F2)抑制口腔鳞癌CAL-27细胞增殖、迁移的作用及机制.方法 采用BrdU染色研究ZNF750对CAL-27细胞周期的影响;蛋白质印迹法检测细胞周期依赖性蛋白激酶CDK4、CDK6、活化Caspase-3及E2F2蛋白的表达;Calcein AM与EthD-1共染研究ZNF750对CAL-27失巢凋亡的影响;肿瘤悬浮成球及Transwell实验研究ZNF750对CAL-27细胞自我更新及侵袭迁移的影响;分析E2F2对CAL-27细胞生物学功能的影响.双荧光素酶报告基因分析ZNF750对系列E2 F2启动子截短体的荧光素酶活性的影响;双荧光素酶报告基因实验、CCK-8及细胞划痕实验分别研究野生型及突变型ZNF750对E2 F2荧光素酶活性、细胞活性及迁移的影响.结果 与oe-Con相比,过表达ZNF750可使细胞周期阻滞于G1期〔(50.07±5.74)％,P=0.010〕、S期细胞减少〔(32.15±2.47)％,P=0.003〕,抑制CDK4(0.19±0.01,P<0.001)、CDK6(0.27±0.00,P<0.001)表达;促进活化Caspase-3(0.92±0.02,P<0.001)蛋白表达,促进CAL-27细胞失巢凋亡,并抑制细胞的自我更新(8.67±1.15,P=0.009)、侵袭(80.60±2.52,P<0.001)及迁移(52.33±3.51,P<0.001).然而,干扰ZNF750基因则引起相反的变化.ZNF750的潜在调控靶标E2 F2则可促进CAL-27细胞肿瘤球形成,细胞侵袭、迁移增强,而降低细胞的失巢凋亡.荧光素酶报告基因结果显示,ZNF750可抑制E2F2的荧光素酶活性(0.375±0.031,P=0.007),尤其是Z+ET8(-154→+100)截短体组(0.057±0.007,P<0.001)的活性;在蛋白水平也证实,ZNF750可抑制E2F2蛋白表达(0.26±0.14,P=0.003).此外,突变ZNF750模序(C2H2和PLNLS)则丧失了其对E2F2的调控及对CAL-27细胞活性、细胞迁移的抑制作用.结论 ZNF750主要通过C2H2和PLNLS模序负调控E2F2的表达抑制CAL-27细胞的增殖与迁移.