长链非编码RNA在PEDV感染Vero-E6细胞中对自噬的调控作用

[目的]试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru,PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用,以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路.[方法]根据GenBank上公布的人lncRNA-HOTAIR基因序列(登录号:NR_047517.1),利用LongMan在线工具筛选lncRNA-HOTAIR的猴源同源序列(lncRNA-M),并利用RNAfold、LncLocator在线预测工具预测其二级结构和核质分布.建立PEDV感染的Vero-E6细胞模型,在0、6、12、24、36和48 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测微管相关蛋白1-轻链3(LC3)蛋白的表达,以明确病毒感染细胞后不同时间点自噬的发生情况.通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-M在PEDV感染Vero-E6细胞模型中0、6、12、24、36和48 h的表达水平.设计并合成3条lncRNA-M的干扰片段:siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3,分别转染Vero-E6细胞,待细胞汇合度达到90％时接毒,感染48 h后利用实时荧光定量PCR检测lncRNA-M的表达情况,筛选出干扰效率最高的干扰片段.将干扰效率最高的干扰片段转染至Vero-E6细胞并接种PEDV后,通过Western blotting检测感染后24和48 h LC3蛋白的表达水平,以验证自噬的发生情况.[结果]成功筛选出lncRNA-HOTAIR猴源同源序列为lncRNA 0.1,并根据RNAfold预测结果生成lncRNA 0.1的RNA最小自由能二级结构;LncLocator预测结果表明,lncRNA0.1在细胞核和细胞质中的分布分别为41.88％和37.78％.PEDV感染Vero-E6细胞48 h后,细胞皱缩、聚集成团,细胞膜融合形成合胞体;1.0％琼脂糖凝胶电泳结果显示,在1 326 bp处出现目的条带,说明PEDV感染Vero-E6细胞模型成功建立.在PEDV感染的Vero-E6细胞模型中,Western blotting结果显示,6、12、24、36和48 h LC3 Ⅱ的表达量呈上升趋势,LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值在48 h最高且极显著高于0 h(P＜0.01);实时荧光定量PCR结果显示,LC3的mRNA表达量在48 h最高,且极显著高于0 h(P＜0.01),自噬被激活;lncRNA 0.1的表达均呈上升趋势,在48 h表达量最高,48 h lncRNA 0.1的表达量极显著高于0 h(P＜0.01);siRNA-2的干扰效果最好,干扰效率为80％.干扰lncRNA 0.1后,Western blotting结果显示,24和48 h干扰组的LC3蛋白表达量均低于对照组,自噬受到抑制.[结论]PEDV感染Vero-E6细胞能够诱导自噬发生,lncRNA 0.1在感染过程中起到了促进自噬的作用.