单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物被膜与消毒剂抗力分析

[目的]研究inlK基因对Lm90SB2菌株生物被膜形成能力的影响及其生物被膜与消毒剂抗力的关系,以期为有效防控单增李斯特菌污染提供参考.[方法]以单增李斯特菌Lm90SB2为试验菌,根据GenBank中公布的单增李斯特菌F2365inlK基因序列(登录号:AE017262),应用Primer Premier 5.0软件设计用于扩增 inlK基因上、下游同源臂片段及验证缺失株的特异性引物,以同源重组技术构建inlK基因缺失株,并通过旁外侧引物运用PCR方法进行缺失株检测.将标准菌株Lm90SB2和构建的缺失株分别培养8、12、24、48 h后进行结晶紫染色,在倒置显微镜下观察形态变化,并用酶标仪测定生物被膜形成能力;用含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液.和含10 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液作为新洁尔灭消毒剂的中和剂,含5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液和含10 g/L硫代硫酸钠+30 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液84消毒剂的中和剂,设消毒剂+菌悬液、消毒剂+菌悬液+中和剂、中和剂+菌悬液、消毒剂+中和剂+菌悬液、稀释液+菌悬液(阳性对照)、稀释液+中和剂+培养基(阴性对照)6个试验组,进行中和剂的筛选,并检测不同浓度新洁尔灭(1 ∶ 15、1 ∶ 30)和84消毒剂(1∶ 50、1 ∶ 100)分别作用1、5、10、20 min时对2株菌的灭菌率.[结果]PCR结果表明,成功构建了缺失株Lm90SB2△inlK,且inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力显著或极显著下降(P＜0.05;P＜0.01);含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液构成的中和剂可有效中和新洁尔灭消毒剂,5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液可有效中和84消毒剂.不同比例的新洁尔灭(1 ∶ 15、1 ∶ 30)和84消毒剂(1∶ 50、1 ∶100)消毒剂在1、5、10 min对Lm90SB2△inlK株的灭菌率均显著或极显著高于Lm90SB2株(P＜0.05;P＜0.01),且在20 min时灭菌率均为100％.[结论]inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力下降,且对消毒剂抗力减弱.