猕猴原代肾小球系膜细胞分离提取培养与鉴定

目的 探索一种简单方便、重复性好的非人灵长类动物原代肾小球系膜细胞(GMCs)体外提取、培养及鉴定的方法.方法 在无菌条件下取出猕猴肾脏,利用两种不同孔径的纱网(介于100目到200目之间)分离出肾小球,设置不同浓度(0.1、0.2 mg/ml)Ⅵ型胶原酶消化肾小球,同时在这两个浓度基础上设置不同消化时间(10、15 min),将消化后的肾小球接种到细胞瓶中,观察不同消化条件下GMCs的生长状况.显微镜下观察GMCs的结构,免疫荧光和Western blot法检测GMCs中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Nephrin蛋白的表达.利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激后观察GMCs生物学特性,CCK-8法和高内涵细胞成像系统法分别检测GMCs活力和增殖情况;Transwell法和细胞划痕实验检测GMCs迁移能力.结果 利用0.1 mg/mlⅥ型胶原酶消化10 min搜集到的肾小球贴壁较多,肾小球细胞生长状态较好.原代培养的肾小球3 d贴壁,7 d开始移出不规则形状或星状的细胞,经21～35 d GMCs逐渐铺满瓶底.GMCs中 α-SMA蛋白阳性,Nephrin蛋白阴性.10 ng/ml TNF-α体外刺激能显著增强GMCs的增殖与迁移能力.结论 利用胶原酶消化法(0.1 mg/mlⅥ型胶原酶消化10 min)成功建立了GMCs的分离及培养的方法体系,为之后更好模拟人类肾脏疾病提供合适的细胞模型.