RNA编辑蛋白OTP82的表达与纯化

目的:利用原核系统表达RNA编辑蛋白OTP82,通过蛋白变复性的方法得到全长蛋白,并优化实验条件提高OTP82的收率.方法:利用原核表达系统表达OTP82全长融合蛋白(HSO),表达后的菌体用高压细胞破碎仪匀浆后收集包涵体并用包涵体洗涤液重复洗涤两遍,然后用含有8 M尿素的变性缓冲液将包涵体搅拌溶解得到蛋白原始液.将蛋白原始液复性后采用镍柱亲和纯化,通过SDS-PAGE和Western-blot检测等方法对HSO的变复性结果进行筛选.结果:通过对复性缓冲液中盐浓度、谷胱甘肽的浓度和比例以及小分子添加剂的探索,得到了 OTP82融合蛋白适合的变复性条件(pH 8.5 100 mM Tris,400 mM NaCl,200 mM精氨酸,5 mM GSH,0.5 mM GSSG,6mM[3-环糊精,2 mM EDTA,1 mM PMSF)复性率达到 2.73％(获得蛋白 0.42 mg/L).结论:通过变复性的方式能够在体外得到OTP82的粗蛋白,为揭示RNA编辑蛋白作用机制提供基础实验依据,为后续利用PPR蛋白进行工程蛋白设计奠定了基础.