非洲猪瘟CD2v截短蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立非洲猪瘟(ASF)抗体检测方法,本研究根据ASFV HLJ18株基因组序列合成CD2v蛋白的胞外区段基因序列,连接至原核表达载体pET28a,构建表达质粒pET28a-CD2v.经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS,构建表达菌株pET28a-CD2v/BL21(DE3)PLysS.经IPTG诱导和镍柱纯化后,获得纯化的CD2v蛋白并经SDS-PAGE和Western blot鉴定.以纯化的CD2v蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件建立检测CD2v抗体的间接ELISA方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性及在临床血清中的应用.结果显示,经测序构建的表达质粒序列正确,CD2v蛋白表达经SDS-PAGE可见略小于25 kDa的条带,Western blot显示能与ASFV感染血清发生特异性反应.建立了 ASFCD2v蛋白抗体检测方法CD2v-ELISA,抗原包被质量浓度为50 μg/L,血清稀释倍数为1 ∶ 100,羊抗猪HRP-IgG稀释倍数为1 ∶ 100 000,阴阳性临界值为0.26;与PRRSV、CSFV、PRV(gI)、PRV(gb)、FMDV血清不发生反应,具有良好的特异性;ASF阳性血清稀释至128 000倍后仍检测为阳性,具有较高的敏感性;重复性结果显示,批间和批内变异系数均小于10％.使用CD2v-ELISA检测154份临床血清,阳性结果74份,阳性率为48.05％.与2个国产、2个进口商品化ASFV抗体试剂盒的检测结果比较,CD2v-ELISA方法跟其他方法的符合率较高,分别为95.45％,94.16％,88.31％,93.51％.因此,本研究成功建立了基于CD2v胞外区段抗原的ELISA方法,可用于ASF临床抗体的检测.