用于转化生长因子β/Smad信号转导通路抑制剂筛选的慢病毒报告载体的构建

目的 构建由转化生长因子β(TGF-β)诱导的含有Smad响应元件(Smad RE)和红色荧光蛋白mCherry或荧光素酶报告基因序列的慢病毒报告载体,为筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂提供有效工具.方法 合成UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-mCherry和UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-lucifer?ase报告基因序列,分别将其插入经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后的pCDH-GFP-Puro-noCMV慢病毒质粒载体,获得响应TGF-β的含有Smad RE和mCherry或荧光素酶报告基因序列的慢病毒报告载体,分别命名为pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase.利用慢病毒三质粒包装系统在293FT细胞中分别包装出慢病毒并感染A549细胞(分别命名为USPG-mCherry A549和USPG-luciferase A549细胞),在倒置荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,鉴定A549细胞是否被感染成功.用TGF-β(10μg·L-1)及其受体拮抗剂LY2109761(5μmol·L-1)和SB431542(10μmol·L-1)分别处理USPG-mCherry A549和USPG-luciferase A549细胞24 h,倒置荧光显微镜下观察USPG-mCherry A549细胞mCherry的表达,用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测USPG-luciferase A549细胞荧光素酶的表达,验证所构建慢病毒报告载体用于筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂的可行性.用TGF-β及其受体拮抗剂LY2109761和SB431542处理A549细胞24 h,Western印迹法检测A549细胞磷酸化Smad2/3蛋白表达,验证LY2109761和SB431542对TGF-β/Smad信号转导通路的抑制作用.结果 经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析,成功构建pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase慢病毒重组质粒;分别转染293FT细胞包装出慢病毒并感染A549细胞,倒置荧光显微镜下观察到被感染的A549细胞表达GFP,表明USPG-mCherry A549和USPG-luciferase A549细胞构建成功.加入TGF-β处理24 h后,USPG-mCherry A549细胞表达mCherry,USPG-luciferase A549细胞表达荧光素酶;而加入LY2109761和SB431542后,USPG-mCherry A549细胞几乎检测不到mCherry的表达,USPG-luciferase A549细胞检测不到荧光素酶的表达.Western印迹法结果表明,TGF-β刺激后A549细胞中有磷酸化Smad2/3蛋白表达,加入LY2109761和SB431542后未检测到磷酸化Smad2/3蛋白表达.结论 成功构建由TGF-β诱导的受Smad调控表达mCherry和荧光素酶的2个慢病毒报告载体,可有效感染目的细胞.该慢病毒报告载体可用于筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂.