弓形虫Ⅱ型ROP16蛋白对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383炎性反应的影响

目的 探讨弓形虫Ⅱ型ROP16蛋白对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383炎性反应的影响.方法 实验设置空白对照组(正常NR8383细胞)、空载组(pHBLV-CMV)和ROP16过表达组(pHBLV-CMV ROP16),构建ROP16过表达慢病毒载体并转染至NR8383细胞中,经筛选得到稳转细胞系,利用RT-PCR和Western blot法验证慢病毒在ROP16过表达组是否转染成功;免疫荧光法确定ROP16蛋白在NR8383细胞中的定位;Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、核转录因子κB(NF-κB)、磷酸化核转录因子κB(P-NF-κB)、信号转导与转录激活因子1(STAT1)及磷酸化转录活化蛋白1(P-STAT1)蛋白的表达情况;RT-PCR检测iNOS、Arg-1及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-10 mRNA水平的表达情况;ELISA检测培养上清中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-10的含量.结果 ROP16过表达慢病毒成功稳转NR8383细胞,镜下可观察到明显绿色荧光;免疫荧光结果显示,ROP16蛋白定位于NR8383细胞核中;West-ern blot结果显示,ROP16过表达组中M1型巨噬细胞表面标志蛋白iNOS的表达高于空白对照组,其通路蛋白NF-κB、P-NF-κB、STAT1、P-STAT1的表达均高于空白对照组(P均<0.05),而M2型巨噬细胞表面标志蛋白Arg-1表达低于空白对照组(P<0.05);RT-PCR结果显示,ROP16过表达组iNOS及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA均升高(P均<0.01),而Arg-1及抗炎因子TGF-β、IL-10 mRNA均下降(P均<0.05);ELISA结果显示,过表达组中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-12含量均高于空白对照组(P均<0.05),而抗炎因子TGF-β和IL-10的表达均低于空白对照组(P均<0.05).结论 弓形虫Ⅱ型ROP16定位于NR8383巨噬细胞核中并稳定表达,同时向M1型巨噬细胞方向极化,引发促炎反应.