SIRT3/MnSOD/ROS参与调控脂肪源性干细胞成骨分化的机制研究

目的:研究脂肪源性干细胞成骨分化过程中,SIRT3/MnSOD/ROS信号通路的调控作用.方法:提取SD大鼠脂肪源性干细胞(adipose derived stem cell,ADSC)并通过细胞表面标志物(CD29、CD44、CD34、CD45)及成骨、成脂多向分化鉴定.体外诱导其成骨分化,检测SIRT3表达情况;利用慢病毒转染抑制SIRT3表达,用茜素红染色检测ADSC成骨分化情况,qPCR检测成骨相关基因Runx2、ALP、OCN的表达,同时利用试剂盒检测锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)的活性及胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平.结果:ADSC成骨分化过程中,细胞内SIRT3 mRNA表达(7 d:1.71±0.03,15.21 ±0.17,P=0.014,n=5;14 d:1.44±0.04,9.70±0.18,P=0.002,n=5)及蛋白质表达(7 d:0.70±0.01,2.99±0.07,P=0.012,n=5;14 d:1.00±0.08,2.74±0.50,P=0.009,n=5)增加.转染SIRT3慢病毒可抑制SIRT3 mRNA表达(7 d:1.02±0.05,0.36±0.01,P=0.011,n=5;14 d:1.04±0.08,0.30±0.02,P=0.002,n=5)及蛋白质表达(7 d:0.88±0.04,0.29±0.01,P=0.034,n=5;14 d:1.18±0.03,0.43±0.01,P=0.014,n=5),导致ADSC成骨分化能力降低,MnSOD活性减弱(0.91±0.13,0.29±0.01,P=0.002,n=5),细胞内ROS水平升高(7 d:1.00±0.10,2.66±0.32,P=0.013,n=5;14 d:1.24±0.10,2.59±0.31,P=0.014,n=5),与成骨相关的相应靶基因Runx2、ALP、OCN表达下降(Runx2:1.07±0.02,0.19±0.01,P=0.001,n=5;ALP:1.09±0.02,0.53±0.01,P=0.001,n=5;OCN:0.95±0.02,0.33±0.01,P=0.004,n=5).加入NAC预处理细胞,可逆转敲减SIRT3对ADSC成骨分化的抑制作用(ROS:2.63±0.20,1.07±0.19,P=-0.010,n=5).结论:ADSC成骨分化过程中,线粒体内SIRT3表达增加.SIRT3通过增强MnSOD的活性来降低胞内ROS水平,从而介导ADSC成骨分化.