苯吡唑草酮抗性菌株的筛选及抗性HPPD基因的克隆与表达

筛选分离对苯吡唑草酮具有高抗性的菌株,并从中克隆抗除草剂苯吡唑草酮的4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)基因,可为研发抗苯吡唑草酮转基因作物提供基因资源.在加入苯吡唑草酮的TMSM平板上筛选到抗苯吡唑草酮的菌株,通过16S rRNA分析确定其分类地位,用PCR扩增出抗性菌株的HPPD基因,构建高效表达载体pET-Enhppd并在大肠杆菌Escherichia coil BL21(DE3)中表达,利用Co2+亲和层析对表达产物进行纯化,通过IC50分析菌株对各种HPPD抑制剂类除草剂的抗性情况.在加入5 600 μmol/L的苯吡唑草酮平板上筛选到一株高抗苯吡唑草酮的革兰氏阴性细菌,命名为Ace-21,并初步鉴定为剑菌属(Ensifer sp.).从菌株Ace-21中克隆到编码HPPD的基因,命名为Enhppd.该基因全长为1 113 bp,编码370个氨基酸,蛋白分子量(M)为41.4×103.EnHPPD与已报道HPPD同源性较低,仅有33.9％-54.6％.在大肠杆菌表达的EnHPPD通过Co2+亲和层析纯化至单一的条带.纯化的EnHPPD具有对羟苯基丙酮酸双加氧酶活性,比酶活为10.2 U/mg.抗性分析结果表明EnHPPD对苯吡唑草酮具有较高的抗性,其IC50为12.7 μmol/L.此外,EnHPPD还对其他HPPD抑制剂类除草剂如硝磺草酮和环磺酮有较强的抗性,其IC50分别达到35.1μmol/L和23.6 μmol/L,显示EnHPPD对其他HPPD抑制剂类除草剂也具有较强的抗性.本研究分离筛选到高抗苯吡唑草酮的细菌Ensifer sp.Ace-21,并从该菌克隆获得其HPPD基因Enhppd;表达纯化的EnHPPD能高抗苯吡唑草酮、硝磺草酮和环磺酮等多种HPPD抑制剂类除草剂,是一个性能比较优良的广谱HPPD抑制剂类除草剂抗性基因资源,在构建HPPD抑制剂类除草剂转基因作物中有很好的应用前景.