CalR激活副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统1相关基因的转录

[目的]研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对calR基因以及CalR对Ⅵ型分泌系统l(type VI secretion system 1,T6SS1;vp1386-1420)相关基因的转录调控关系.[方法]提取副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株的总RNA,采用实时定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)研究调控子对靶基因的转录调控关系;采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断调控子对靶基因的调控关系;将靶基因的启动子区克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入WT和调控子基因突变株中,获得LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验进一步研究调控子对靶基因的调控关系.PCR扩增靶基因的上游调控区DNA序列,并纯化His-重组调控子蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究His-重组蛋白对靶基因调控区DNA序列是否具有直接的结合作用,若有结合作用,则进一步采用DNase I足迹实验研究具体的结合位点.[结果]在细菌生长密度(OD600)从 0.05依次增加到1.20时,CalR的表达水平呈梯度升高特征;QS系统在低细胞密度下的核心调控子AphA对calR基因的转录没有调控作用,而高细胞密度下的核心调控子OpaR对calR基因的转录具有间接的激活作用.此外,在非诱导条件下,CalR直接结合到vp1388-1390、vp1393-1406、vp1400-1406和vp1409-1407启动子区DNA序列上促进它们的转录.[结论]OpaR间接激活CalR的表达,而CalR是非诱导条件下维持T6SS1基础表达所必需的调控子.