灭癌素链霉菌中磷硫酰化修饰DNA结合结构域的功能分析

[目的]DNA磷硫酰化(phosphorothioation,PT)是由硫原子取代DNA骨架磷原子上的非桥联氧原子形成的一种新型DNA修饰.PT修饰除参与组成限制修饰系统外,其更为广泛的生物学功能仍有待揭示.PT修饰现有的检测方法操作复杂、成本高、耗时长,而具有操作简便、成本低、耗时短等特点的酶联免疫检测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)成为新PT检测方法开发的优选.灭癌素链霉菌(Streptomyces gancidicus)中具有天蓝色链霉菌中PT修饰依赖的IV型限制酶(ScoMcrA)的同源酶,暗示其同样含有特异性结合PT修饰DNA的硫结合结构域(sulfur binding domain,SBD).本文对灭癌素链霉菌中的SBD(简称为Sg-SBD)与PT修饰DNA的亲和力进行定性检测与定量表征,评估其用于PT修饰ELISA方法开发的潜力.[方法]对ScoMcrA-SBD和Sg-SBD的氨基酸序列进行比对分析,利用ScoMcrA-SBD为模板进行同源建模.在大肠杆菌中异源表达Sg-SBD,利用纯化的Sg-SBD进行凝胶迁移(electrophoresis mobility shift assays,EMSA)检测.利用生物膜层干涉(biolayer interferometry,BLI)技术进行Sg-SBD结合PT修饰DNA的定量表征.[结果]生物信息学分析揭示了Sg-SBD含有结合硫原子的保守的氨基酸残基,同时表明Sg-SBD具有与ScoMcrA-SBD相似的结构.EMSA实验发现Sg-SBD可以结合PT修饰DNA形成明显的迁移带,初步证实Sg-SBD结合PT修饰DNA的活性.BLI数据显示,Sg-SBD具有比ScoMcrA-SBD更强的PT修饰DNA结合能力,其与PT修饰DNA的亲和力常数在nmol/L级别,并且Sg-SBD不结合非PT修饰DNA.[结论]Sg-SBD结合PT修饰DNA活性接近抗原-抗体的反应水平,可用于PT修饰DNA ELISA快速检测方法的开发.