清肝利水方调控TRPC6/Ca2+通路抑制慢性青光眼RGC凋亡的研究

目的 观察清肝利水方(QGLS)在慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞(RGC)凋亡中的抑制效果,并探讨其作用机制与瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)/Ca2+信号通路的关系.方法 制备大鼠QGLS含药血清,进行细胞毒性试验,确定合适的干预浓度.用CoCl2和无糖DMEM建立RGC-5细胞缺氧缺糖-复氧复糖损伤模型,CCK-8检测正常对照组(CG)、模型组(MG)和低、中、高浓度清肝利水方含药血清组(LQGLS、MQGLS、HQGLS)的细胞增殖力,细胞凋亡试验检测细胞凋亡水平,Western Blot检测各组TRPC6、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bax)和半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达,Fluo-3 AM荧光探针检测细胞内钙离子浓度.结果 (1)实验条件筛选:筛选出QGLS含药血清干预浓度为5％,CoCl2造模浓度与时间为600μM处理24h.(2)细胞存活率:LQGLS、MQGLS可显著提高缺氧缺糖-复氧复糖损伤的细胞存活率,与MG比较有统计学意义(tLQGLS=25.401,tMQGLS=11.805,均P=0.000).(3)TRPC6表达:MQGLS、HQGLS较MG显著降低,差异均有统计学意义(tMQGLS=7.365,tHQGLS=9.075,均 P=0.000).(4)凋亡因子:①Caspase-3表达,3个 QGLS 剂量组较MG均显著下降,差异均有统计学意义(tLQGLS=4.816,P=0.001;tMQGLS=35.131,P=0.000;tHQGiS=28.227,P=0.000);②Bax表达,3个QGLS剂量组较MG均显著下降,差异均有统计学意义(tLQGLS=14.912,tMQGLS=10.194,tHQGLS=12.838,均 P=0.000);③Bcl-2表达,3个 QGLS 剂量组较 MG 均显著升高,差异均有统计学意义(tLQGLS=8.871,tMQGLS=12.729,tHQGLS=9.298,均P=0.000).(5)细胞内Ca2+荧光强度:MG及3个QGLS剂量组较CG均显著升高,差异具有统计学意义(tMG=13.960,P=0.000;tLQGLS=5.889,P=0.001;tMQGLS=7.877,P=0.000;tHQGLS=17.815,P=0.000).LQGLS、MQGLS较MG细胞内Ca2+浓度显著下降,差异具有统计学意义(tLQGLS=7.881,tMQGLS=6.204,均P=0.000),HQGLS较MG差异无统计学意义(P＞0.05).结论 QGLS可降低RGC-5中Caspase-3、Bax表达,提高Bcl-2表达,抑制RGC凋亡,保护视神经,其作用机制可能与降低TRPC6表达以减少Ca2+内流相关.