小续命汤通过下调USP9X调控NLRP3泛素化水平干预急性肺损伤的机制研究

目的 探究小续命汤通过下调泛素特异性蛋白酶9X(USP9X)干预脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)炎症反应机制.方法 制备含药血清,使用10％小续命汤含药血清预处理Ⅱ型肺泡上皮细胞.①小续命汤对LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞炎症及功能的影响:实验分为空白组、LPS诱导组、LPS+小续命汤组.ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-8(IL-8)水平.qRT-PCR和Westernblot检测紧密连接蛋白Occludin、Z0-1、Claudin的表达.②小续命汤通过USP9X发挥改善ALI细胞模型的炎症及功能:实验分为空白组、LLPS诱导组、LPS+小续命汤组.PCR和Western blot检测USP9X的表达.③USP9X与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)蛋白相互作用:人肺泡上皮细胞内USP9X过表达后,Co-IP联合质谱检测USP9X与NLRP家族互作,通过Western blot验证确定NLRP3与USP9X的关系.④小续命汤缓解LPS导致的人肺泡上皮细胞焦亡:实验分为空白组、LPS诱导组、LPS+小续命汤组.Western blot检测NLRP3、IL-1β、Pro-IL-1β、Caspase-1、Pro-Caspase-1,PCR检测NLRP3、IL-1β、Caspase-1,CCK-8检测细胞焦亡.结果 ①与模型组比较,小续命汤预处理显著减少LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-8的蛋白表达水平(P＜0.05),显著增加紧密连接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin的蛋白和mRNA表达水平.②与模型组比较,小续命汤含药血清预处理显著降低USP9X的转录及蛋白水平的表达(P＜0.05).③Co-IP联合质谱检测USP9X与NLRP家族互作,通过Western blot验证确定NLRP3与USP9X存在互作.④与模型组比较,小续命汤预处理显著减少LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞NLRP3、IL-1β、Pro-IL-1β、Caspase-1、Pro-Caspase-1的蛋白和转录水平,缓解细胞焦亡的发生(P＜0.05).结论 小续命汤能有效改善急性肺损伤,该作用可能与下调USP9X调控NLRP3泛素化水平的表达相关.