宿主分子Tyro3对猪瘟病毒复制的影响及其与E2蛋白相互作用的研究

本研究室前期研究发现受体酪氨酸激酶家族(TAM)成员Mertk为猪瘟病毒(CSFV)的侵入因子.为研究TAM受体家族另外两个成员Tyro3及Axl对CSFV复制的影响,本研究设计并合成了针对Tyro3、Mertk、Axl的siRNA (siTyro3、siMertk、siAxl)和一条无关siRNA(siNC),将这3种siRNA分别转染PK-15细胞,24 h后以MOI 0.01感染CSFV-SM,48 h后经荧光定量PCR检测各分子的表达以及CSFV基因拷贝数.荧光定量PCR结果显示,3种siRNA分子均能够下调PK-15细胞中Tyro3、Axl和Mertk的转录水平,且下调Mertk、Tyro3后CSFV基因组拷贝数均极显著降低,下调Axl后CSFV基因组拷贝数却无显著变化.因此选择siTyro3转染PK-15细胞后以MOI 0.01 CSFV-SM感染PK-15细胞,通过荧光定量PCR及间接免疫荧光试验(IFA)检测siTyro3的转录水平以及CSFV的复制情况,结果显示,Tyro3基因的转录水平、CSFV基因组拷贝数及病毒滴度均显著降低,表明下调Tyro3的表达能够抑制CSFV的复制.按常规方法包装制备Tyro3慢病毒Lenti-Tyro3-HA,将其转导PK-15细胞,传10代后每代均经荧光显微镜观察,并将第10代转导细胞分别经荧光定量PCR和western blot鉴定.结果 可见转导的细胞每代均发出绿色荧光,荧光定量PCR和western blot结果显示,第10代转导细胞中Tyro3基因的转录水平极显著上升,且可检测到Tyro3的特异性条带.表明获得了稳定表达Tyro3蛋白的PK-15细胞系PK-Tyro3-HA.将CSFV-SM分别以MOI 1和0.1感染PK-Tyro3-HA细胞系后经荧光定量PCR检测,结果显示CSFV基因组拷贝数分别升高了1.5倍(MOI 1)和2.3倍(MOI 0.1),表明过表达Tyro3后能够促进细胞中CSFV的复制.将不同剂量的兔源Tyro3多克隆抗体(pAb)与PK-15细胞共孵育,封闭PK-15细胞表面Tyro3表位后感染rCSFV-Rluc,经海肾荧光素酶检测,结果显示,20 μg/mL和40 μg/mL的Tyro3 pAb孵育细胞后再感染rCSFV-Rluc组的海肾荧光素酶活性显著降低,表明Tyro3 pAb能够抑制CSFV的复制.将pCAGGS-Tyro3-HA分别与pCAGGS-E2-Flag、pCAGGS-Erns-Flag共转染HEK293T细胞48 h后,进行免疫共沉淀试验,结果显示Tyro3与CSFV E2囊膜糖蛋白存在相互作用.综上,本研究首次证实Tyro3通过与CSFV E2囊膜糖蛋白的相互作用促进CSFV在PK-15细胞中的复制,为进一步揭示CSFV与宿主细胞的相互作用提供参考依据.