基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建敲除DDX5基因的猪肾细胞系
Chinese Veterinary Science（2021）
摘要
利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,建立DDX5基因敲除的PK-15细胞系.使用E-CRISPR在线设计网站分别对猪DDX5第1外显子和第2外显子设计sgRNA,以质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(pX459)为载体,将退火后的sgRNA连接到线性化载体pX459上,得到敲除载体pX459-sgRNA-DDX5.以脂质体Lipofectamine 2000转染pX459-sgRNA-DDX5至PK-15细胞,经嘌呤霉素压力筛选得到单克隆细胞,通过扩增基因组DDX5序列进行测序和Western-blot鉴定筛选细胞系中DDX5敲除效果.DNA测序结果表明:sgRNA被成功插入载体pX459,并在靶向基因编辑位点产生移码突变;经Western-blot验证,敲除细胞系中DDX5蛋白基本不表达.上述结果表明,本研究采用CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除DDX5基因的PK-15细胞系.
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