定点突变提高羰基还原酶ChKRED03的热稳定性

羰基还原酶不对称还原前手性酮生成相应的手性醇,广泛应用于手性药物、农业化学品和液晶材料等结构复杂的化合物的合成.本实验室自有羰基还原酶ChKRED03催化3,5-二(三氟甲基)苯乙酮、1-苯基-2-丙烯基-1-酮类、N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮(NBPO)等底物具有优异的立体选择性和良好的活力,但是该酶较低的热稳定性不利于其进一步应用.因此采用蛋白质工程的方法提高其热稳定性.利用FireProt在线工具和序列一致性原理预测了该酶热稳定相关氨基酸位点,通过理性选择8个位点,构建了单点突变体并识别了4个有益突变位点,进一步将其整合得到了热稳定性大幅度提高的组合突变体M8314 (T183V/N188L/A211P/S224P).该突变体最适反应温度为40℃,比野生型ChKRED03提高了10℃,其催化底物NBPO的活性是野生型的116％.M8314在40℃的热失活半衰期为52 h,是野生型的200倍.本研究成功提高了羰基还原酶ChKRED03的热稳定性,增加了该酶工业化应用的潜力,所采用的分子进化策略也为其他酶的热稳定性改造提供了思路.