山羊DGAT1基因的克隆及对前体脂肪细胞脂质沉积的调控作用研究

旨在克隆山羊DGAT1基因序列,明确DGAT1基因在山羊不同组织中的表达模式,并进一步揭示过表达DGA T1基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质代谢的影响.本试验以10月龄健康简州大耳公羊(n=7)为试验动物.采用RT-PCR法克隆山羊DGAT1基因序列,并对序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测DGA T1在山羊不同组织中的相对表达水平;采用双酶切法构建pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体并转染至山羊肌内前体脂肪细胞;使用RT-qPCR检测DGA T1过表达效率及脂质代谢相关基因的表达情况;通过油红O染色法观察过表达DGAT1对脂滴形成的影响,利用GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量.结果 显示,获得山羊DGA T1基因序列全长1651 bp(GenBank登录号:MT221183),包含5 'UTR 125 bp,CDS 1470 bp,3'UTR 56 bp,编码489个氨基酸残基;山羊DGAT1基因在小肠中的表达量最高,在脾中表达量最低;RT-qPCR检测结果显示,DGA T1在细胞中过表达极显著(P＜0.01),GPAM基因的相对表达水平显著上调(P＜0.05),ADRP和ACOX1基因极显著上调(P＜0.01),而AGPA T6基因相对表达水平显著下调(P＜0.05),MLYCD和HSL基因极显著下调(P＜0.01);油红O染色结果显示,过表达DGA T1后脂滴聚积相较于对照组极显著增多(P＜0.01),甘油三酯测定结果显示,过表达DGAT1基因可极显著增加山羊肌内脂肪细胞甘油三酯含量(P＜0.01).本研究成功获得山羊DGAT1基因CDS区序列并构建了pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体,过表达DGAT1可显著促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积,并显著影响脂质代谢相关基因的表达,这些结果为进一步阐明DGAT1对调控山羊肌内脂肪代谢的作用机制提供了重要数据.