TNF-α诱导小鼠乳腺上皮细胞凋亡和程序性坏死研究

[目的]本试验旨在探究肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导对小鼠乳腺上皮细胞凋亡和程序性坏死的影响.[方法]体外培养小鼠乳腺上皮细胞系(HC-11细胞)并分为4个处理组:对照(Ctrl)组、TNF-α(T)组、TNF-α+CHX(环己酰亚胺)(TC)组和TNF-α+CHX+Z-VAD-FMK(Caspase家族抑制剂)(TCZ)组.向细胞中加入TNF-α(20、50、100 ng·mL-1)、CHX(4μmol·L-1)、Z-VAD-FMK(20μmol·L-1),分别处理12 h和24 h,检测细胞活力和细胞凋亡及程序性坏死相关基因和蛋白的表达,利用透射电镜观察不同处理后细胞的超微结构变化.[结果]与对照组相比,100 ng·mL-1 TNF-α(T-100)处理12 h后细胞活力极显著降低(P<0.001),50 ng·mL-1 TNF-α(T-50)和100 ng·mL-1 TNF-α(T-100)处理24 h后细胞活力极显著降低(P<0.01),所有TC和TCZ处理12 h和24 h后细胞活力极显著降低(P<0.001);光学显微镜下观察发现T、TC和TCZ处理后细胞呈不同程度死亡;与对照组相比,T组和TC组Bax/Bcl-2和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均显著上升(P<0.05);T组和TC组Caspase-8 mRNA表达水平极显著上升(P<0.01),而TCZ组Caspase-8 mRNA水平极显著降低(P<0.001),TC组和TCZ组RIP3、MLKL mRNA表达水平极显著上升(P<0.001),但只有TCZ组程序性坏死标志蛋白RIP3、MLKL和p-MLKL表达量极显著上升(P<0.01),且p-MLKL/MLKL蛋白表达比值显著上升(P<0.05);与对照组相比,TCZ组细胞内出现空泡、线粒体肿胀、断裂等坏死细胞所具有的细胞超微结构变化;TC组和TCZ组PGAM5 mRNA表达水平极显著上升(P<0.001),TCZ组PGAM5蛋白表达水平极显著上升(P<0.01),TC组和TCZ组Drp1 mRNA和蛋白表达水平均极显著上升(P<0.01).[结论]TNF-α和TNF-α+CHX处理均可诱导小鼠乳腺上皮细胞凋亡,TNF-α+CHX+Z-VAD-FMK处理可诱导小鼠乳腺上皮细胞发生程序性坏死.