根皮素对过氧化氢诱导的牛脂肪源性干细胞氧化应激的缓解作用

本研究旨在探究根皮素(PT)对过氧化氢(H2O2)诱导的牛脂肪源性干细胞(ADSCs)氧化应激和凋亡的影响.试验选取牛脂肪组织,使用Ⅳ型胶原酶分离牛ADSCs,传代培养后利用免疫荧光对牛ADSCs表面标记蛋白CD29、CD44、CD73及Vimentin进行鉴定.用不同浓度(0、100、200、500、1000μmol/L)的过氧化氢(H2O2)处理牛ADSCs 24 h,通过CCK?8法检测细胞存活率,筛选构建牛ADSCs氧化应激模型的适宜H2 O2浓度.利用CCK?8法检测不同浓度(0、10、50、100μmol/L)PT作用4 h后牛ADSCs的存活率,确定PT对牛ADSCs进行预保护的适宜浓度.随后先用不同浓度(0、10、50μmol/L)PT预处理牛ADSCs 4 h,对牛ADSCs进行预保护;再利用500μmol/L H2 O2处理牛ADSCs 24 h.采用试剂盒检测牛ADSCs内氧化应激相关指标,包括丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH?DA)测定细胞内活性氧(ROS)含量;实时荧光定量PCR(qRT?PCR)检测细胞凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl?2)及半胱天冬酶-3(Caspase?3)mRNA相对表达量.结果显示:500μmol/L的H2O2能引起牛ADSCs存活率极显著下降(P<0.01),可以用来诱导其发生氧化应激.10和50μmol/L的PT不会对牛ADSCs的存活率产生显著影响(P>0.05),而100μmol/L的PT会引起牛ADSCs的存活率显著下降(P<0.05),因此后续试验选用10、50μmol/L的PT处理牛ADSCs进行4 h的预保护.免疫荧光检测结果显示,牛ADSCs中CD29、CD44、CD73及Vimentin蛋白表达呈阳性;氧化应激相关指标检测结果显示,与空白组(0μmol/L PT预保护,0μmol/L H2 O2处理)相比,500μmol/L H2 O2极显著增加牛ADSCs内MDA含量(P<0.01),极显著降低牛ADSCs内SOD活性(P<0.01),说明500μmol/L H2O2处理牛ADSCs引起了氧化应激.与氧化应激组(0μmol/L PT预保护,500μmol/L H2O2处理)相比,10或50μmol/L PT与500μmol/L H2 O2共处理可以显著减少牛ADSCs内MDA含量(P<0.05),50μmol/L PT与500μmol/L H2 O2共处理可以显著增加牛ADSCs内SOD活性(P<0.05),说明适宜浓度的PT可以缓解H2 O2诱导的牛ADSCs氧化应激.ROS染色结果显示,10、50μmol/L PT与500μmol/L H2 O2共处理均可极显著降低牛ADSCs内ROS含量(P<0.01),同样说明适宜浓度的PT可以缓解H2 O2诱导的牛ADSCs氧化应激.此外,qRT?PCR检测结果显示,与空白组相比,500μmol/L H2 O2显著增加牛ADSCs内促凋亡基因Bax和Caspase?3 mRNA相对表达量(P<0.05),极显著减少牛ADSCs内抗凋亡基因Bcl?2 mRNA相对表达量(P<0.01),说明500μmol/L H2O2处理可以引起牛ADSCs凋亡.而10或50μmol/L PT与500μmol/L H2O2共处理时,牛ADSCs内凋亡相关基因mRNA相对表达量与氧化应激组没有显著差异(P>0.05),说明在本试验的条件下,PT不会缓解H2O2诱导的牛ADSCs凋亡.综上所述,适量的PT可以有效缓解H2O2诱导的牛ADSCs氧化应激.